連環(huán)蛋白P120介導(dǎo)肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文連環(huán)蛋白P120介導(dǎo)肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究姓名：張毅申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：外科學(xué)（普外）指導(dǎo)教師：董家鴻20060501第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文表達(dá)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在包括HCC在內(nèi)的許多惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中，MMP2均扮演著十分重要的角色，并常常與腫瘤的惡性程度相關(guān)。然而，MMP2基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制尚不十分明了。本實(shí)驗(yàn)主要探討P120ctn—Kaiso復(fù)合體是否參與MMP一2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。明確這些調(diào)控過程將有助于深

2、入理解HCC侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。材料與方法：1、通過免疫組化的方法研究58例HCC、17例肝硬化、8例正常肝組織標(biāo)本中P120ctn及Ecadherin、Dcatenin分布表達(dá)情況，明確其與HCC臨床病理之間的聯(lián)系。2、從人基因組DNA中PCR擴(kuò)增出MMP2啟動(dòng)子DNA，PCR定點(diǎn)突變技術(shù)擴(kuò)增包含有Kaiso結(jié)合位點(diǎn)突變的啟動(dòng)子，通過酶切位點(diǎn)KpnI／XhoI一起克隆到報(bào)告質(zhì)粒PGL3一BASIc上；PCR擴(kuò)增出全長(zhǎng)的KaisocDN

3、A，通過酶切位點(diǎn)SalI／XbaI克隆到帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的真核表達(dá)載體PEGFPC3上；通過螢火蟲酶活性分析檢測(cè)Kaiso是否參與MMP一2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控；以染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)Kaiso與MMP2啟動(dòng)子之間是否存在體內(nèi)結(jié)合關(guān)系。3、構(gòu)建P120ctn的腺病毒載體(攜帶分子標(biāo)記HA—tag)，用其轉(zhuǎn)染本身不表達(dá)MMP2的肝癌細(xì)胞株HepG2。通過RTPCR、明膠酶譜的方法檢測(cè)過度表達(dá)的外源性P120ctn是否可以誘導(dǎo)HepG2

4、細(xì)胞分泌MMP一2。利用Transwell小室檢測(cè)外源性P120ctn的表達(dá)是否能增強(qiáng)HepG一2細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力。結(jié)果及結(jié)論：1、P120ctn在正常肝組織中只見胞膜染色，而HCC和肝硬化組織中分別有38／58(655％)、8／17(471％)出現(xiàn)異常表達(dá)。P120ctn的異常表達(dá)主要表現(xiàn)為胞膜表達(dá)減弱或缺失，并伴胞漿分布。P120ctn的異常表達(dá)與HCC的包膜形成、淋巴浸潤(rùn)、有無衛(wèi)星灶、腫瘤分化等均相關(guān)，而與性別、年齡、瘤體積大

5、小、分期無關(guān)。而Ecadherin與pcatenin的異常表達(dá)僅與腫瘤包膜形成和腫瘤分化有關(guān)。P120ctn在HCC和肝硬化組織中異常表達(dá)的比例顯著高于E—cadherin(448％)和B—catenin(379％)，且P120ctn與E—cadhedn或D—catenin的表達(dá)無關(guān)，提示P120ctn可能是HCc轉(zhuǎn)移的更早期事件。P120ctn可以作為一個(gè)新的預(yù)測(cè)肝癌轉(zhuǎn)移的因子。2、成功構(gòu)建了多個(gè)包含Kaiso結(jié)合部位突變的PGL3一