新一代聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞胺酶基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的：原發(fā)性肝癌細(xì)胞是精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞，精氨酸脫亞胺酶(arginine deiminase，ADI)可分解精氨酸，使肝癌細(xì)胞失去營(yíng)養(yǎng)供給而死亡，卻不影響正常細(xì)胞的生長(zhǎng)。本課題擬研制新一代聚乙二醇(PEG)修飾的ADI，并完成該藥物生物學(xué)特性的基礎(chǔ)研究。 方法：采用了全基因合成的方式，以大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子來(lái)設(shè)計(jì)并合成ADI的全基因。構(gòu)建原核表達(dá)載體pET3a—ADI，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3(pLyss)，篩選陽(yáng)性克隆I

2、PTG誘導(dǎo)發(fā)酵4小時(shí)。發(fā)酵液離心，收集菌體，高壓勻漿破碎后離心。用PBS洗滌包涵體，包涵體增溶復(fù)性后，經(jīng)陰離子交換層析，疏水層析和精氨酸親和層析法純化目標(biāo)蛋白。采用體外精氨酸降解試驗(yàn)測(cè)定酶的活性。控制PEG修飾基本反應(yīng)條件，以新一代PEG修飾技術(shù)修飾rADI，修飾后的產(chǎn)物PEG—rADI用疏水柱ResourcePHE純化。用Fe(SCN)法測(cè)定PEG修飾率。活性測(cè)定方法與rADI的一致。分別用體外肝癌細(xì)胞抑制試驗(yàn)、H22移植瘤模型藥效試

3、驗(yàn)、正常鼠免疫原性試驗(yàn)完成PEG—rADI的動(dòng)物體內(nèi)、外生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果：成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET3a—ADI，通過(guò)改進(jìn)發(fā)酵工藝，增加目標(biāo)蛋白的百分表達(dá)率。優(yōu)化ADI發(fā)酵產(chǎn)物的包涵體復(fù)性工藝，使復(fù)性收率提高到40％以上?；钚詼y(cè)定表明，純化后rADI的比活性達(dá)到40IU/mg。新一代PEG修飾的ADI降低了ADI的免疫原性，其酶活力與其修飾率有關(guān)。動(dòng)物體內(nèi)、體外生物學(xué)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：抑瘤效果與美國(guó)鳳凰制藥公司研制的PEG—A