同型半胱氨酸對體外神經(jīng)干細胞增殖與凋亡的影響及其機制的探討.pdf

1、目的:研究同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)對體外胎鼠神經(jīng)干細胞(neuralstem cells,NSCs)增殖和凋亡作用的影響,探討其相關機制。
　　 方法:取孕14-16 d胎鼠腦組織,采用機械吹打法獲得神經(jīng)干細胞,利用含有bFGF和EGF因子的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)NSCs細胞。實驗分組:將獲得的胎鼠NSCs分為4組:①正常對照組(Control組)；②Hey低劑量組(Hcy-L組):培養(yǎng)液中添加30μmol/m

2、l的Hcy；③Hey中劑量組(Hcy-M組):培養(yǎng)液中添加300μmol/ml的Hcy；④Hcy高劑量組(Hcy-H組):培養(yǎng)液中添加1mmol/ml的Hcy。大部分細胞培養(yǎng)至增殖第6d,收集進行免疫標記、基因、蛋白及凋亡率的測定,另一部分細胞于增殖第6d,以胎牛血清誘導細胞分化,至第13d對分化細胞進行鑒定。NSCs的鑒定:采用免疫組化法檢測神經(jīng)生物學標記物Nestin、GFAP、β-tublin-Ⅲ,BrdU摻入法檢測細胞增殖力；H

3、cy對NSCs增殖的影響:通過MTT法檢測不同濃度Hcy影響下不同時間點NSCs增殖情況,并繪制生長曲線；免疫雙標法和5-溴2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo2-deoxylxridine,BrdU)摻入法計算Nestin/BrdU雙標陽性細胞占增殖細胞的比例；RT-PCR法檢測NSCs增殖相關基因表達的情況；Hcy對NSCs凋亡的影響:利用流式細胞儀單熒光染色法檢測NSCs的細胞凋亡率,RT-PCR法檢測ERK1/2 mRNA表達情況

4、、WesternBlot法檢測pERK1/2蛋白表達的情況。
　　 結果:從胎鼠腦組織分離以含bFGF、EGF的無血清IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)的、細胞表達NSC特異性標志Nestin抗原,BrdU標記顯示為陽性,且可分化成神經(jīng)元及神經(jīng)膠質細胞,證明所培養(yǎng)的細胞為NSCs,且具有一定的增殖和自我更新的能力。MTT結果顯示:培養(yǎng)48h后Hcy低、中、高劑量組NSCs OD值均低于Control組,且存在劑量-反應關系(P<0.05),說明

5、Hcy能抑制NSCs的增殖；免疫組化雙標法結果表明:添加Hcy組Nestin/BrdU雙標陽性均低于Control組,差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且隨著Hcy劑量的升高,陽性率下降；NSCs各組Id2、Hes1、Notch1基因的表達都隨著Hcy劑量的增加逐漸減低(P<0.05),說明Hcy有可能是通過抑制增殖相關基因如Id2、Hes1、Notch1發(fā)揮作用。流式細胞術檢測結果顯示,Hcy對NSCs的凋亡率有所影響,Control

6、組細胞凋亡率最低,為19.43％,而Hcy-H組最高,凋亡率為25.37％,但差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；添加Hcy各組能抑制ERK1/2基因及pERK1/2蛋白的表達(P<0.05),且隨著Hcy劑量的升高,表達量下降,存在劑量-反應關系。
　　 結論:本實驗成功的分離、培養(yǎng)胎鼠NSCs,具有NSCs的基本特征,并且具有增殖和自我更新能力。Hcy可抑制NSCs的增殖,其機制可能是與Id2、Hes1、Notch1基因的表達