姜黃素對大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖促進(jìn)作用的機(jī)制探討.pdf

1、目的:
　　觀察姜黃素暴露于大鼠神經(jīng)干細(xì)胞后，是否對神經(jīng)干細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響。觀察姜黃素對發(fā)育相關(guān)基因(GR，Stat3，Notch1，P21)及其蛋白的影響，并探討其相關(guān)影響機(jī)制。
　　方法:
　　神經(jīng)干細(xì)胞的獲取和培養(yǎng):取孕15天(E15) SD大鼠，麻醉后取其大腦皮質(zhì)，分離出原代神經(jīng)干細(xì)胞接種到DMEM/F12的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代至第二代進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志蛋白(nestin)和胚胎干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白(SO

2、X2)進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞染色鑒定及姜黃素暴露處理。姜黃素處理:實驗隨機(jī)分為三組，分別為對照組(Control group)，溶劑組(DMSO group)，姜黃素組(Curcumin group)，對照組無任何處理，溶劑組為0.1％二甲基亞砜(DMSO)，姜黃素組中姜黃素的的濃度分別為0.1，0.5，2.5，12.5，62.5μM，溶于0.1％ DMSO中，暴露時間為24 h。姜黃素對神經(jīng)干細(xì)胞的毒性、活力及增殖作用檢測:姜黃素暴露大鼠神經(jīng)

3、干細(xì)胞24 h后，乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測細(xì)胞毒性;MTT法檢測細(xì)胞活力及BrDU增殖試劑盒檢測神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。選擇無細(xì)胞毒性且促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)的姜黃素劑量組，重新進(jìn)行實驗分組:對照組(control group)，溶劑組(DMSOgroup)，姜黃素組(Curcumin)，進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞暴露，24 h后提取細(xì)胞RNA及蛋白，標(biāo)本凍存待用?；蚣暗鞍讬z測:熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法(qPCR)檢測神經(jīng)干細(xì)胞GR，Stat3

4、，Notch1和P21 mRNA表達(dá);Western blot法檢測神經(jīng)干細(xì)胞GR，Stat3， p-Stat3蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，原代細(xì)胞經(jīng)Nestin和SOX2蛋白染色陽性率大于98％，經(jīng)鑒定為神經(jīng)干細(xì)胞。LDH法檢測結(jié)果顯示12.5和62.5μM組姜黃素對神經(jīng)干細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用（P0.05），其他劑量無影響;MTT結(jié)果顯示0.5，2.5μM組姜黃素可增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞活力，62.5μM

5、組姜黃素降低神經(jīng)干細(xì)胞活力（均P＜0.05)，其他劑量無影響;BrDU結(jié)果顯示0.1，0.5，2.5μM組姜黃素促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖（P＜0.05)，12.5，62.5μM組姜黃素抑制神經(jīng)干細(xì)胞增殖（均P＜0.05），其他劑量無影響。以上實驗表明低劑量組姜黃素?zé)o細(xì)胞毒性作用且0.5μM組姜黃素對神經(jīng)干細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用最強(qiáng)，因此姜黃素分組重新設(shè)定為0.5μM組進(jìn)行后續(xù)基因蛋白檢測。qPCR結(jié)果顯示，0.5μM劑量組GR mRNA表達(dá)量發(fā)生