鱗柄白鵝膏抑菌成分及其對(duì)楊樹(shù)爛皮病菌抑制機(jī)理.pdf

1、本文運(yùn)用植物病理學(xué)、分子生物學(xué)，生物化學(xué)、有機(jī)化學(xué)等方法，對(duì)毒蘑菇菌株及其抑菌活性物質(zhì)對(duì)楊樹(shù)爛皮病菌的影響、抑菌活性成分分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定、抑菌活性物質(zhì)室內(nèi)生物測(cè)定及生態(tài)安全性檢驗(yàn)、抑菌活性物質(zhì)發(fā)酵條件及穩(wěn)定性、抑菌活性物質(zhì)對(duì)楊樹(shù)爛皮病菌的抑制機(jī)理及鱗柄白鵝膏與楊樹(shù)爛皮病菌分類(lèi)的分子生物學(xué)驗(yàn)證及生理學(xué)特性進(jìn)行研究，取得以下結(jié)果： (1)從9種毒蘑菇中篩選出抑制楊樹(shù)爛皮病菌的高效菌株——鱗柄白鵝膏。對(duì)鱗柄白鵝膏抑菌活性物質(zhì)的篩選結(jié)

2、果表明鱗柄白鵝膏抑菌活性物質(zhì)既存在于菌液中又存在于菌絲體中；高溫高壓降低抑菌物質(zhì)活性；搖床培養(yǎng)可提高菌液中抑菌活性物質(zhì)含量。過(guò)濾液抑菌活性物質(zhì)最佳提取工藝為：搖床培養(yǎng)、正丁醇或乙酸乙酯提取、超聲波處理；菌絲體中抑菌活性物質(zhì)最佳提取工藝為：搖床培養(yǎng)、水或乙醇提取、超聲波處理50min。 (2)通過(guò)對(duì)鱗柄白鵝膏抑菌活性物質(zhì)的兩次凝膠分離純化，利用 FT-IR 紅外光譜、紫外吸收光譜和 LC-MS 聯(lián)機(jī)方法對(duì)鱗柄白鵝膏抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行

3、結(jié)構(gòu)分析結(jié)合生測(cè)檢驗(yàn)，結(jié)果表明：抑菌活性物質(zhì)含有5個(gè)組分，5個(gè)組分均為酰胺類(lèi)物質(zhì)或混合物，對(duì)病菌均有顯著抑制效果。組分A 由 2種酰胺類(lèi)物質(zhì)組成，A1分子量為 5732.39，A2分子量為 7187.01；組分B為一種酰胺，分子量為5186.57；組分C是3種酰胺類(lèi)物質(zhì)的混合物，C1分子量為5336.44，C2分子量1057.99，C3分子量1877.57；組分D是3種酰胺類(lèi)物質(zhì)的混合物，D1分子量為3118.51，D2分子量為3046

4、.40，D3分子量為1877.57；組分E也含有3種酰胺類(lèi)物質(zhì)，E1分子量為1185.30，E2分子量為3099.95，E3分子量為3558.47。確定了B和C1的基本結(jié)構(gòu)框架。 (3)通過(guò)室內(nèi)生物測(cè)定研究了鱗柄白鵝膏抑菌活性物質(zhì)對(duì)樹(shù)爛皮病的控制效果，結(jié)果表明鱗柄白鵝膏粗提液及粗提液分離物Ⅳ對(duì)楊樹(shù)爛皮病預(yù)防效果顯著，預(yù)防效果都達(dá)到87.0％；發(fā)病盛期對(duì)楊樹(shù)爛皮病的控制也有一定的效果，防治效果分別達(dá)到了34.8％和41.3％。通過(guò)

5、小鼠毒性試驗(yàn)檢測(cè)鱗柄白鵝膏抑菌活性物質(zhì)生態(tài)安全性，結(jié)果顯示鱗柄白鵝膏菌絲體小鼠飼喂 LD<,50>為 418.70 mg/kg，95％可信限為 453.11～386.90mg/kg，為低毒。菌液對(duì)生態(tài)安全。 (4)研究了鱗柄白鵝膏抑菌活性物質(zhì)的發(fā)酵條件及其穩(wěn)定性，結(jié)果表明碳源是影響鱗柄白鵝膏菌絲生物量和抑菌活性物質(zhì)活性的主要因素。適合鱗柄白鵝膏菌絲生長(zhǎng)和抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生的最佳碳源為乳糖，最佳氮源為蛋白胨；適于抑菌活性物質(zhì)生長(zhǎng)的最

6、佳的培養(yǎng)基組合：乳糖 3％，蛋白胨 0.5％，MgSO<,4>0.15％，KH<,2>PO<,4>0.45％。乳糖是抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生最重要的因素。鱗柄白鵝膏菌絲生長(zhǎng)和抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件分別為：pH值5～6，溫度25℃～30℃，接種量為1％左右，裝液量為50％，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為 120r/min～160r/min，培養(yǎng)時(shí)間15d～20d。鱗柄白鵝膏抑菌物質(zhì)敏感溫度為高于75℃，敏感酸堿度為pH值大于9或小于4，紫外照射時(shí)間超過(guò)4

7、h會(huì)嚴(yán)重影響抑菌物質(zhì)活性。 (5)通過(guò)楊樹(shù)爛皮病菌糖代謝過(guò)程中幾種關(guān)鍵酶的變化初步探討了鱗柄白鵝膏對(duì)楊樹(shù)爛皮病的抑制機(jī)理，其結(jié)果如下：鱗柄白鵝膏抑菌活性物質(zhì)對(duì)病原菌的7種酶活性都有不同程度的影響，使己糖激酶活力降低，丙酮酸激酶活力、琥珀酸脫氫酶活力、乳酸脫氫酶活力和ATP酶活力提高，致使楊樹(shù)爛皮病菌的呼吸作用加快，產(chǎn)生大量的活性氧自由基，使病原菌細(xì)胞生物膜受到損傷；病原菌體內(nèi)過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和總超氧岐化酶3種生物體

8、防御系統(tǒng)的酶的含量極低，自身的清除能力低，不能及時(shí)清除呼吸作用急劇加快產(chǎn)生的活性氧自由基，對(duì)體內(nèi)生物分子產(chǎn)生損傷作用。隨著鱗柄白鵝膏培養(yǎng)粗提液濃度的增加受害程度加大。 (6)研究了鱗柄白鵝膏與楊樹(shù)爛皮病菌2個(gè)菌株的分類(lèi)地位及生理學(xué)特性，其結(jié)果顯示：鱗柄白鵝膏rDNA ITS序列長(zhǎng)度為516bp，GenBank登錄號(hào)為EF403032，確認(rèn)本論文試驗(yàn)中的鱗柄白鵝膏為Amanita virosa。鱗柄白鵝膏生長(zhǎng)最適溫度25℃，最適p

9、H值為5-7，最適碳源為甘露醇，最適氮源為酵母膏。最適培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，硫酸鎂1.5g，磷酸二氫鈉3g，瓊脂20g，水1000mL。 楊樹(shù)爛皮病菌ITS序列長(zhǎng)度為907bp，GenBank 登錄號(hào)為EF101159，確認(rèn)本論文試驗(yàn)中的楊樹(shù)爛皮病菌為 Ctospora chrysosperma。楊樹(shù)爛皮病菌生長(zhǎng)最適溫度 30℃，最適pH值為5～6，最適碳氮源分別是葡萄糖和蛋白胨。最適培養(yǎng)基配方：馬鈴薯20