轉(zhuǎn)移性前列腺癌受甲基化調(diào)控基因的篩選與臨床價值研究.pdf

1、本文從以下四方面進行了議論：
　　第一部分 轉(zhuǎn)移性前列腺癌的轉(zhuǎn)移能力差異篩選
　　目的:在前列腺癌細(xì)胞株中篩選出侵襲和轉(zhuǎn)移能力最強的細(xì)胞株，為進一步尋找與前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的腫瘤標(biāo)記物提供依據(jù)。材料與方法:體外培養(yǎng)LNCaP，22RV1，PC-3和DU145細(xì)胞株，通過細(xì)胞劃痕試驗，Transwell侵襲試驗和Transwell遷移試驗觀測細(xì)胞株之間侵襲和轉(zhuǎn)移能力的差異，并通過明膠酶譜試驗監(jiān)測細(xì)胞MMPs的分泌情況。結(jié)果:

2、通過體外實驗篩選，我們得到侵襲和轉(zhuǎn)移能力差異最大的兩株細(xì)胞LNCaP和PC-3。劃痕試驗證實PC-3較LNCaP的遷移速率高7.31倍(p＜0.05)，侵襲試驗中PC-3較LNCaP侵襲細(xì)胞數(shù)高3.38倍(p＜0.05)。兩株細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力均有明顯差異，通過進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)，兩株細(xì)胞的MMPs水平差異十分顯著。結(jié)論:在體外PC-3較LNCaP具有更強的侵襲轉(zhuǎn)移能力，且分泌更多的基質(zhì)金屬蛋白酶。
　　第二部分 受甲基化調(diào)控

3、差異表達(dá)基因的高通量篩選與驗證
　　目的:通過比較LNCaP和PC-3細(xì)胞基因組DNA甲基化與mRNA表達(dá)水平的差異，篩選受甲基化調(diào)控的基因并進行驗證。材料與方法:通過甲基化譜測序(MBD-seq)檢測前列腺癌細(xì)胞系PC-3和LNCaP全基因組DNA甲基化修飾情況，并通過轉(zhuǎn)錄組測序的方法（RNA-seq）檢測PC-3和LNCaP全轉(zhuǎn)錄組表達(dá)。利用生物信息學(xué)的方法分析在兩種細(xì)胞中受甲基化調(diào)控的基因。結(jié)果:通過高通量測序與篩選，我們發(fā)

4、現(xiàn)了(CAV1，CAV2，MET，PPARG，COL6A1，ALDH6A1，ALDH2, SMAD3, ITGA6, ITGB8, MCCC1, CAPN2, JAK1, LAMB1)14個受甲基化調(diào)控，可能影響前列腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移能力差異的基因。并對其中7個基因的甲基化改變進行了驗證。結(jié)論:通過高通量測序分析DNA甲基化譜改變與mRNA表達(dá)水平改變可以快速有效地分析出受甲基化調(diào)控的基因。
　　第三部分 候選基因COL6A1的體外功

5、能驗證
　　目的:在功能上驗證受甲基化調(diào)控的COL6A1基因在體外是否具有促進侵襲轉(zhuǎn)移的作用。材料與方法:構(gòu)建表達(dá)針對COL6A1的shRNA與過表達(dá)COL6A1的載體并包裝慢病毒，改變原有細(xì)胞系COL6A1的表達(dá)情況，通過侵襲和劃痕試驗檢測細(xì)胞系的功能改變。并對下游信號通路分析進行進一步分析。結(jié)果:在本底表達(dá)低的細(xì)胞系LNCaP1中過表達(dá)COL6A1，遷移速率較對照組提高50％(p＜0.05)，侵襲細(xì)胞數(shù)較對照組提高78.1％(

6、p＜0.05)，MMP9和CXCR4的表達(dá)顯著提高。在本底表達(dá)COL6A1較高的PC-3中沉默COL6A1的表達(dá)，遷移速率較空載對照組降低59.4％(p＜0.05)，侵襲細(xì)胞數(shù)較對照組減少66.2％(p＜0.05)結(jié)論:在體外實驗中COL6A1具有促進PC-3和LNCaP侵襲遷移能力的作用。
　　第四部分 候選基因COL6A1的臨床價值研究
　　目的:在臨床樣本中檢測COL6A1是否對前列腺癌轉(zhuǎn)移具有預(yù)測價值。材料與方法:選

7、取于2007-2011年在我院診治的223例確診為前列腺腺癌患者與40例非前列腺腺癌對照的前列腺組織切片，回顧性的收集患者臨床資料。通過免疫組化染色比較隊列中COL6A1的表達(dá)水平，并分析與臨床轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。結(jié)果:在多因素回歸中，Gleason評分(OR=4.204，95％CI=1.360 to12.999，p=0.013)，T分期(OR=43.912，95％CI=12.340 to156.263，p＜0.01)與COL6A1表達(dá)水平(