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文檔簡介
1、背景與目的:
口腔扁平苔蘚(Oral Lichen Planus,OLP)是最常見的口腔粘膜病之一,目前病因不明,無特異有效的治療方法,病程遷延,反復發(fā)作,且具有一定的惡變傾向,是口腔臨床醫(yī)師面臨的一大難題。該疾病的發(fā)病與精神、內分泌、免疫、感染等多種因素相關,其中目前一致認為免疫因素是最重要的病因。大量的研究表明OLP固有層內是以T細胞為主的淋巴細胞浸潤,且上皮內和鄰近病變基底膜的角質細胞多數為激活的CD8+T淋巴細胞,提示
2、CD8+T細胞介導的細胞免疫是OLP發(fā)病的主要因素。但其中具體的分子機制尚不明確。
胸腺基質淋巴細胞生成素(Thymic Stromal Lymphopoietin,TSLP)是一種最近發(fā)現的與CD8+T細胞介導的免疫應答密切相關的細胞因子。研究表明TSLP主要由上皮細胞產生,是體外誘導CD8+T細胞激活并發(fā)揮細胞毒性的一個重要因子。TSLP能直接或者通過活化樹突狀細胞(Dendric Cells,DCs)間接作用于CD8+T
3、細胞,不僅能維持其穩(wěn)定增殖,還能使CDS+T細胞分化為細胞毒性T細胞,產生大量的IFN-γ,發(fā)揮細胞毒性作用。目前研究發(fā)現TSLP在多種如過敏性皮炎、哮喘等自身免疫性疾病中異常表達,且通過調控T細胞免疫功能影響疾病的發(fā)生發(fā)展,但其中具體的調控機制不明,尚需進一步研究明確。
我們推測TSLP可能在OLP的免疫病理機制中發(fā)揮著重要作用,并可能通過與CD8+T細胞的相互作用,影響著OLP疾病的發(fā)生和發(fā)展。為了深入研究TSLP在OLP
4、發(fā)病中作用及其機制,我們一方面通過體內實驗對OLP組織切片和患者外周血清進行相關檢測,觀察TSLP及其受體在口腔扁平苔蘚組織和血清中的表達規(guī)律;另一方面通過體外實驗研究TSLP與CD8+T細胞之間是否存在相互作用。此實驗的研究結果不僅對OLP的免疫病因機制提供了分子學基礎,還將為未來OLP的免疫治療提供新的理論依據。
材料和方法:
第一部分
1.我們隨機選取了35例病理確診為OLP的患者粘膜標本進行組織染色
5、,同時以11例健康志愿者的正常粘膜標本作對照;另收集了36例OLP患者血清進行血清學檢測,同時以35例健康志愿者血清作為對照。
2.用免疫組織化學的方法分別檢測OLP組織及健康對照組織粘膜標本TSLP及其受體(TSLPR)的原位表達,并進一步利用免疫熒光雙染技術檢測OLP固有層內CD8+T細胞表面TSLPR的表達規(guī)律。
3.利用ELISA檢測OLP患者及健康對照外周血提取的血清中TSLP的分泌情況。
第二部
6、分
1.體外中性蛋白酶/膠原酶/胰蛋白酶聯合消化法分離正??谇徽衬そ琴|細胞,用含生長因子的OKM培養(yǎng)基進行原代及傳代培養(yǎng),并利用角蛋白抗體行細胞免疫化學染色鑒定培養(yǎng)細胞的上皮性來源。
2.取生長狀態(tài)良好的第3代口腔角質細胞按適當密度接種于六孔板中,分別加入100ng/ml的炎癥細胞因子rhIL-4、rhTNF-α和rhIFN-γ,分別作用0、6h、9h、12h、24h、48h、72h,并在不同時間點分別提取各組口腔角
7、質細胞的蛋白和mRNA,利用Western blot和實時定量PCR技術分別檢測不同時間點角質細胞細胞內合成TSLP蛋白和mRNA的情況。同時利用ELISA檢測不同時間點各組細胞培養(yǎng)上清內TSLP的表達情況,找尋影響口腔角質細胞合成和分泌TSLP的敏感刺激因素。
第三部分
1.體外Ficoll密度梯度離心法分選外周血單個核細胞(PMBC),利用CD3和CD8免疫磁珠經過兩次陽性選擇分離原代CD8+CD3+細胞(即CD
8、8+T細胞),流式細胞儀檢測細胞純度。
2.將分選的原代CD8+T細胞體外以anti-CD3mAb和anti-CD28 mAb誘導活化,加入rhTSLP作用72小時,與口腔角質細胞共培養(yǎng)24小時研究其殺傷效應。同時設立rhTSLP刺激未活化CDS+T細胞組、CD3/CD28刺激組以及無刺激的medium組作為對照。檢測前徹底沖洗去除懸浮生長的CD8+T細胞,倒置相差顯微鏡下觀察各組口腔角質細胞的形態(tài)改變,通過MTT法檢測尋找能
9、夠誘發(fā)CD8+T細胞產生殺傷功能的最佳效靶比例,利用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測及流式細胞術檢測與CD8+T細胞共培養(yǎng)的各組口腔角質細胞的早期凋亡。通過檢測口腔角質細胞的早期凋亡間接反應rhTSLP對于活化CD8+T細胞殺傷角質細胞的影響。
結果:
第一部分
1.TSLP在OLP患者口腔粘膜上皮中的表達(67%±31.65%)明顯高于健康對照組(8%±3.78%)(P<0.05),主要表達于異
10、常增殖的角質細胞的細胞膜上;而且基底層角質細胞中TSLP的表達與固有層內浸潤的淋巴細胞的數量呈現明顯的正相關關系;固有層內大量的淋巴細胞表達TSLPR(45%±23.56%),且約10%的TSLPR+細胞表達于CD8+T細胞上。
2.外周血清學檢測結果示OLP患者中的TSLP表達水平(7.61±2.60 pg/ml)明顯高于正常健康人(0.21±0.13 pg/ml);但兩種臨床類型的OLP患者的血清學檢測結果不存在統(tǒng)計學差異
11、(P>0.05)。
第二部分
1.體外利用酶消化法成功分離并培養(yǎng)了口腔角質細胞,經角蛋白染色鑒定,>95%的細胞表達角蛋白陽性,證明其上皮性來源及細胞純度。
2.口腔角質細胞內TSLP的蛋白水平在rhIFN-γ作用組隨時間呈現先降后升的動態(tài)變化。在作用48小時前細胞內TSLP的蛋白水平明顯降低,作用72h明顯回升接近正常水平;而rhIL-4作用組、rhTNF-α作用組口腔角質細胞內的TSLP的蛋白水平持續(xù)降
12、低。各組口腔角質細胞TSLP mRNA水平的變化趨勢與蛋白水平基本一致,但在rhIFN-γ組,口腔角質細胞內的TSLP mRNA的變化明顯早于蛋白水平,在48小時即接近正常水平,到作用72小時其mRNA水平明顯增高,達到正常組的2.32倍。
3.口腔角質細胞培養(yǎng)上清中TSLP的表達水平僅在rhIFN-γ作用72小時檢測到,為10.74±5.32 pg/ml;而rhIL-4作用組和rhTNF-α作用組均沒有檢測到TSLP的分泌。
13、
第三部分
1.利用Ficoll密度梯度離心法和免疫磁珠分選技術從外周血成功分離原代CD8+T淋巴細胞,經過流式細胞檢測細胞純度達到96%以上。
2.效靶比(CD8+T細胞:口腔角質細胞)為10∶1時CD8+T細胞的殺傷效果最明顯。
3.形態(tài)學觀察發(fā)現,與CD3/CD28誘導活化的CD8+T細胞共培養(yǎng)的口腔角質細胞均出現明顯的凋亡征象,加入rhTSLP后發(fā)生凋亡的口腔角質細胞明顯增多;無刺激med
14、ium對照組和rhTSLP刺激的未活化CD8+T細胞組均未發(fā)現明顯的凋亡征象。
4.細胞凋亡檢測發(fā)現rhTSLP能明顯刺激CD3/CD28活化CD8+T細胞組中口腔角質細胞的早期凋亡(39.2%±8.58%),明顯高于其他各組(P<0.01);而rhTSLP刺激未活化CD8+T細胞組(13.2%±2.41%)與無刺激的Medium對照組(10.2%±3.36%)中口腔角質細胞的早期凋亡率沒有明顯差異(P>0.05)。
15、 結論:
1.本實驗發(fā)現了TSLP在OLP病變粘膜組織和外周血清中的異常表達;而且TSLP在OLP上皮中表達與固有層內浸潤的淋巴細胞的數量呈明顯正相關關系,提示TSLP在OLP的免疫病理機制中起著重要作用。
2.本實驗結果證實rhIFN-γ是影響口腔角質細胞合成TSLP和分泌TSLP的主要炎癥細胞因子。提示在OLP發(fā)病過程中,固有層內活化的T淋巴細胞分泌的IFN-γ為主的細胞因子能促進與其鄰近的基底層角質細胞對TSL
16、P的合成和分泌,并可以解釋第一部分免疫組化結果發(fā)現的“基底層角質細胞中TSLP的表達與固有層內浸潤的淋巴細胞的數量呈現明顯的正相關關系”。
3.本實驗結果證明rhTSLP能促進CD3/CD28活化的CD8+T淋巴細胞對口腔角質細胞的殺傷作用,而對未活化的CD8+T細胞沒有直接作用。提示在OLP中,IFN-γ誘導角質細胞異常分泌的TSLP可能會作用于與其鄰近的固有層內活化的CD8+T淋巴細胞,促進其對鄰近基底膜角質細胞的殺傷作用
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