抗胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)全人源單鏈抗體的篩選及特性分析.pdf

1、目的:抗體針對(duì)相應(yīng)抗原具有高度的特異性和親和性，使抗體在疾病的診斷和治療中顯示出了其他類型藥物無可比擬的優(yōu)勢?？贵w藥物經(jīng)歷了多克隆抗體、單克隆抗體、基因工程抗體三個(gè)階段。多克隆抗體來自于B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體混合物，親和力相對(duì)較高但特異性不好;單克隆抗體來自于單個(gè)B細(xì)胞，特異性強(qiáng)純度高但多為鼠源性抗體，對(duì)于人體存在排斥反應(yīng);基因工程抗體又稱重組抗體，是利用重組DNA及蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)編碼抗體的基因按不同需要進(jìn)行改造和重組而制備的抗體，目前基因

2、工程抗體主要包括有嵌合抗體、人源化抗體、全人源抗體等。近年，抗體藥物向低抗原性、高特異性方向發(fā)展，利用體外篩選技術(shù)篩選全人源抗體成為抗體藥物主要發(fā)展趨勢。人胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(thymic stromallymphopoietin，TSLP)是一種新型的、與白細(xì)胞介素-7（IL-7）類似的細(xì)胞因子，當(dāng)過敏性炎癥發(fā)生時(shí)其在皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞高度表達(dá)，能強(qiáng)烈刺激髓系樹突狀細(xì)胞(Den-driticcell，DC)介導(dǎo)的Th2

3、型炎癥反應(yīng)發(fā)生。在全基因組相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)TSLP基因是一種與易患過敏性疾病相關(guān)的位點(diǎn)之一[1]。在小鼠、靈長類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚2-4]中，已證實(shí)TSLP是誘導(dǎo)Th2型過敏性炎癥疾病的關(guān)鍵啟動(dòng)因子。鑒于TSLP在過敏性疾病中發(fā)生的重要作用，本研究通過噬菌體展示技術(shù)從天然噬菌體抗體文庫中篩選抗TSLP全人源單鏈抗體，并對(duì)篩選的單鏈抗體進(jìn)行特性分析，為過敏性炎癥疾病提供新的治療途徑。
　　方法:擴(kuò)增TSLP cDNA，將目的基因與表達(dá)載

4、體pET101/D-TOPO連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化鑒定。以生物素化TSLP蛋白為抗原利用噬菌體展示技術(shù)對(duì)前期構(gòu)建的天然抗體文庫進(jìn)行3輪富集，用ELISA檢測技術(shù)從富集的單鏈抗體文庫中篩選抗TSLP全人源單鏈抗體(scFv)。用BstNⅠ酶切方法對(duì)篩選抗TLSP-scFv陽性克隆子進(jìn)行指紋圖譜分析;將指紋圖譜不同的克隆子連接LZ16載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后進(jìn)行表達(dá)純化，用Dot blot及We

5、stern blot方法對(duì)表達(dá)純化的抗TLSP-scFv蛋白進(jìn)行鑒定;用間接非競爭ELISA分析純化后抗TLSP-scFv抗體效價(jià);用競爭ELISA方法檢測scFv和TSLP受體與TSLP的競爭結(jié)合，分析scFv與TLSP受體是否作用于TSLP的同一抗原表位，從而達(dá)到封阻TSLP與受體結(jié)合的功能;用大分子相互作用分析技術(shù)對(duì)抗TSLP全人單鏈抗體進(jìn)行特異性及親和力分析。
　　結(jié)果:①.TSLP抗原的表達(dá)純化及鑒定:對(duì)TSLP基因的開

6、放閱讀框(ORF)進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的TSLP cDNA片段大小為423 bp左右;將cDNA與pET101/D-TOPO連接，轉(zhuǎn)化BL21進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)的TSLP蛋白大小為26 KDa左右;Dot blot及Western blot鑒定顯示表達(dá)的蛋白正確，為TSLP目的蛋白。②.抗TSLP全人源單鏈抗體篩選與表達(dá):以生物素化TSLP蛋白為抗原，采用噬菌體展示技術(shù)對(duì)全人源抗體文庫進(jìn)行3輪富集，通過ELISA檢測有35％的scFv與T

7、SLP有結(jié)合特性;將與TSLP結(jié)合能力強(qiáng)的單鏈抗體基因與原核分泌性表達(dá)載體LZ16相連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體scFv-LZ16，對(duì)單鏈抗體進(jìn)行表達(dá)及純化，結(jié)果顯示scFv在大腸桿菌DH5aF'中主要為分泌性表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物主要集中在細(xì)胞周質(zhì)間，為可溶性表達(dá)，抗體具備生物學(xué)活性。③.抗TSLP全人源單鏈抗體特性分析:SDS-PAGE電泳顯示純化后的單鏈抗體大小為27 KDa左右，Dot blot、Western blot及測序結(jié)果顯示表達(dá)純化

8、的單鏈抗體蛋白正確;非競爭ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示表達(dá)的單鏈抗體可與抗原良好結(jié)合，對(duì)單鏈抗體進(jìn)行倍比稀釋，隨著單鏈抗體蛋白濃度降低，與抗原結(jié)合能力隨之降低，單鏈抗體最低可以稀釋至100倍;大分子相互作用實(shí)驗(yàn)(Blitz)結(jié)果顯示抗TSLP全人源單鏈抗體特異性好，與其他相關(guān)細(xì)胞因子沒有交叉反應(yīng)，與相應(yīng)抗原TSLP反應(yīng)較好且得到親和力KD值為10-7，可見篩選得到抗TSLP全人源單鏈抗體有較高特異性和親和力;競爭ELISA結(jié)果顯示:TLSPR