硼替佐米增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性及機(jī)理研究.pdf

1、目的:胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，特別多見于亞洲國(guó)家如中國(guó)，日本和韓國(guó)。多數(shù)病人在診斷時(shí)已屬晚期，聯(lián)合化療的預(yù)后很差。目前尚無(wú)進(jìn)展期胃癌的確切有效治療方案。
　　 近年來(lái)，生物制劑如單克隆抗體與化療藥物的聯(lián)合在乳腺癌，結(jié)腸癌和肺癌的治療中取得顯著的療效。這些結(jié)果證實(shí)了生物制劑與化療藥物聯(lián)用比單獨(dú)化療有效，且進(jìn)一步提示其它生物制劑如細(xì)胞因子等與化學(xué)制劑的聯(lián)合也可能有更好的療效。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(Tumor nec

2、rosis factor(TNF)-relatedapoptosis-inducing ligand，TRAIL)是TNF超家族的成員之一，可與死亡受體結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。和TNF家族的其它成員不同，TRAIL可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞毒性很輕。更為重要的是，TRAIL誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)比其它TNF成員輕。TRAIL對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性毒性和僅誘導(dǎo)低水平炎癥反應(yīng)使得它有可能成為有效的特異性抗腫瘤藥物。應(yīng)用TRAIL受體激動(dòng)型抗體的臨

3、床實(shí)驗(yàn)研究在一些實(shí)體腫瘤中已取得一定療效。
　　 雖然TRAIL對(duì)大多數(shù)腫瘤有很好的活性，但研究也發(fā)現(xiàn)一些腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡存在天然或獲得性耐藥。全面了解TRAIL耐藥機(jī)理是克服耐藥，將TRAIL應(yīng)用于臨床治療的前提。有報(bào)告TRAIL與受體結(jié)合可激活NF-κB(nUClear factorkappa—B)，繼而啟動(dòng)抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，阻止細(xì)胞發(fā)生凋亡。抑制NF-κB活性可增加一些腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性。但

4、是在有些時(shí)候，NF-κB失活不能增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡。這些矛盾的結(jié)果提示NF-κB活化不能保護(hù)所有細(xì)胞逃避TRAIL誘導(dǎo)的凋亡。NF—κB在不同腫瘤細(xì)胞中對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的影響需要進(jìn)一步研究。
　　 除NF-κB外，其它信號(hào)傳導(dǎo)通路也參與TRAIL耐藥。Phosphatidylinositol3-kinase(PI3K)/Akt是重要的信號(hào)通路，可調(diào)控細(xì)胞生存，增殖及凋亡。它可被多種刺激激活，通常發(fā)揮抗凋亡作用。有報(bào)告P

5、I3K/Akt信號(hào)通路與TRAIL耐藥有關(guān)。使用特異性抑制劑或小RNA干擾阻斷PI3K/Akt通路可逆轉(zhuǎn)一些細(xì)胞對(duì)TRAIL的原發(fā)耐藥。
　　 關(guān)于增強(qiáng)TRAIL敏感性的研究已在多種腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行，如肺癌和結(jié)腸癌等。近年來(lái)的研究顯示一些化學(xué)制劑可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性，但是目前為止這些制劑都不能用于臨床治療。硼替佐米是一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白酶體抑制劑，已經(jīng)被美國(guó)食品與藥品管理局(U.S. Food and Drug

6、Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)用于多發(fā)性骨髓瘤和套細(xì)胞淋巴瘤的治療。硼替佐米的主要抗腫瘤功能是阻止NF-κB的抑制體IκB在蛋白酶體中降解，從而阻斷NF-κB活化。有報(bào)告硼替佐米可與TRAIL協(xié)同，增強(qiáng)TRAIL對(duì)一些原發(fā)耐藥細(xì)胞誘導(dǎo)的凋亡，如非小細(xì)胞肺癌，卵巢癌和胰腺癌。這些結(jié)果鼓勵(lì)我們將硼替佐米與TRAIL聯(lián)合用于胃癌的治療。本研究以三種胃癌細(xì)胞系為模型，研究硼替佐米對(duì)TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響，包括caspase裂解

7、，線粒體膜電位的變化和對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響，以及NF—κB和PI3K/Akt通路在TRAIL誘導(dǎo)凋亡中的作用。
　　 材料與方法:
　　 1.采用MTT方法測(cè)定細(xì)胞活力，繪制生存曲線。
　　 2.采用流式細(xì)胞術(shù)PI染色進(jìn)行細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期檢測(cè)。
　　 3.采用流式細(xì)胞術(shù)DiOC6染色測(cè)定線粒體膜電位變化。
　　 4.采用Western blot法檢測(cè)蛋白的表達(dá)。
　　 5.采用Lipof

8、ectamine2000試劑進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)以均數(shù)±S表示。兩組間差異采用Student’s t test分析。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 一、硼替佐米增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性
　　 1.50ng/mL的TRAIL作用于三種細(xì)胞24h后，細(xì)胞存活率分別為72.67士4.93％，92.33士5.86％，和98.33士2.31％。延長(zhǎng)TRA

9、IL作用時(shí)間到48h，或提高TRAIL濃度至1000ng/mL，均不能進(jìn)一步增強(qiáng)TRAIL的毒性。流式細(xì)胞術(shù)PI染色結(jié)果提示TRAIL作用24h后，三種細(xì)胞系中亞二倍體比率不足8％。
　　 2.50nM硼替佐米單獨(dú)作用胃癌細(xì)胞僅引起輕度細(xì)胞死亡。50nM硼替佐米預(yù)處理可增強(qiáng)TRAIL對(duì)三種胃癌細(xì)胞的毒性。在MGC803細(xì)胞，聯(lián)合用藥可將細(xì)胞活力從70.42士1.14％減低到34.85士2.83％，細(xì)胞凋亡從8.22±0.83％增

10、強(qiáng)到31.27士2.02％。類似的協(xié)同作用也見于另兩種細(xì)胞系。
　　 3.50nM硼替佐米和50ng/mL TRAIL單獨(dú)作用于三種胃癌細(xì)胞系，24h后均可見到線粒體跨膜電位的下降。硼替佐米預(yù)處理2h后再予TRAIL作用24h，線粒體跨膜電位被進(jìn)一步降低。在MGC803細(xì)胞，TRAIL單獨(dú)作用24h可使線粒體跨膜電位下降10.97士4.66％，硼替佐米聯(lián)合TRAIL可使線粒體膜電位下降54.27士7.71％，與TRAIL單藥相比

11、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05.在SGC7901，BGC823細(xì)胞中，硼替佐米預(yù)處理也可進(jìn)一步增強(qiáng)TRAIL引起的線粒體跨膜電位下降，但是與TRAIL單藥相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 4.50nM硼替佐米預(yù)處理三種細(xì)胞系2h后，加入50ng/mL TRAIL繼續(xù)作用12h，三種細(xì)胞系中G2/M期細(xì)胞比率明顯增加。與TRAIL聯(lián)用并未進(jìn)一步增加G2/M期阻滯。
　　 5.TRAIL或硼替佐米單獨(dú)作用于SGC7901細(xì)胞24h均不能

12、誘導(dǎo)caspase8活性片段的產(chǎn)生，但二者聯(lián)用可明顯裂解caspase8，繼而裂解caspase3，同時(shí)Caspase3及caspase8前體明顯減少。相似的caspase變化也見于其它兩種胃癌細(xì)胞系。硼替佐米聯(lián)合TRAIL對(duì)死亡受體DR5，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2，Bax的表達(dá)無(wú)明顯影響，但是可輕度下調(diào)cIAP-1的表達(dá)。硼替佐米單藥可明顯上調(diào)Survivin表達(dá)，與TRAIL聯(lián)用并未進(jìn)一步增加表達(dá)上調(diào)。
　　 二、TRAIL活

13、化NF-κB通路阻止胃癌細(xì)胞凋亡
　　 1.50ng/mL TRAIL處理SGC7901細(xì)胞30min后可活化NF-κB，Western blot可檢測(cè)到清晰的IκB降解。而TNF可于更早時(shí)間激活NF-κB，在處理后15min即可檢測(cè)到IκB降解，且其降解程度明顯強(qiáng)于TRAIL誘導(dǎo)的IκB降解。
　　 2.用空載體或編碼磷酸化缺陷突變型HA標(biāo)記IκB(HA-IκB)的cDNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染8GC7901細(xì)胞48h，加入50ng

14、/mL TRAIL繼續(xù)作用24h，轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞僅7.09±0.84％發(fā)生凋亡，而轉(zhuǎn)染突變型HA-IκB的細(xì)胞中凋亡細(xì)胞升至17.80±2.34％，兩組有顯著性差異，P＜0.05。
　　 三、硼替佐米抑制PI3K/Akt通路，逆轉(zhuǎn)胄癌細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的耐藥
　　 1.50ng/mL TRAIL處理SGC7901細(xì)胞1h可檢測(cè)到Akt的磷酸化，其磷酸化水平隨時(shí)間逐漸升高，8h升至最高點(diǎn)，之后逐漸下降，16h后降至

15、基礎(chǔ)水平。
　　 2.50nM硼替佐米預(yù)處理SGC7901細(xì)胞2h后，再以TRAIL處理8h，磷酸化Akt水平不能被進(jìn)一步提高，提示硼替佐米抑制了TRAIL引起的PI3K/Akt通路活化。50μM的LY294002預(yù)處理細(xì)胞1h后，再以TRAIL處理8h，基線水平和TRAIL誘導(dǎo)的Akt磷酸化水平均被有效抑制，且LY294002對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的Akt磷酸化水平的抑制與硼替佐米相似。
　　 3.TRAIL或LY29400

16、2單獨(dú)作用于SGC7901細(xì)胞24h后，亞二倍體細(xì)胞僅占5％左右，而兩藥聯(lián)合后亞二倍體細(xì)胞升至18.38±0.77％，與TRAIL單藥組相比有顯著性差異，P＜0.05。
　　 結(jié)論:
　　 1.人胃癌細(xì)胞系對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡耐藥。
　　 2.亞毒性劑量的硼替佐米可協(xié)同TRAIL抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　 3.硼替佐米促進(jìn)caspases裂解，降低線粒體跨膜電位，下調(diào)抗凋亡蛋白cIAP-1，

17、但對(duì)Bax，Bcl-2表達(dá)水平無(wú)明顯影響。
　　 4.硼替佐米單獨(dú)或與TRAIL聯(lián)合可引起G2/M期阻滯，同時(shí)伴有Survivin表達(dá)上調(diào)。
　　 5.TRAIL可活化SGC7901細(xì)胞中NF-κB通路，特異性抑制NF-κB活性可部分逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的耐藥，提示在胃癌細(xì)胞中NF-κB主要發(fā)揮抗凋亡作用。
　　 6.TRAIL可活化胃癌細(xì)胞中PI3K/Akt通路，硼替佐米抑制TRAIL引起的PI3K/A