索拉非尼聯(lián)合表阿霉素對乳腺癌MCF-7細胞的協(xié)同殺傷作用.pdf

1、研究背景：
　　 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,據(jù)資料統(tǒng)計,其發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7-10％,在女性一生中患乳腺癌的可能性約為10％,是女性目前發(fā)病率最高的惡性腫瘤。它的發(fā)病常與遺傳有關(guān),以40-60歲之間、絕經(jīng)期前后的婦女發(fā)病率較高。癌變通常發(fā)生在乳房腺上皮組織,是一種嚴(yán)重影響婦女身心健康甚至危及生命的最常見的惡性腫瘤之一。從發(fā)展趨勢來看,20世紀(jì)以來乳腺癌的發(fā)病率在全世界各國均是上升趨勢。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),中國婦女

2、發(fā)病的高峰年齡較美國提前10年,發(fā)病年齡提前這一特點無疑將對社會及家庭造成更大的危害?，F(xiàn)在治療乳腺癌的方法由以往單一的手術(shù)治療模式轉(zhuǎn)向以手術(shù)為主,放療、化療、內(nèi)分泌治療相結(jié)合的綜合治療模式。隨著對腫瘤治療的研究進展,一種全新的生物治療模式成為治療乳腺癌的選擇方式之一。乳腺癌的生物治療進展表明其相對于傳統(tǒng)治療模式的優(yōu)越性,大大提高了乳腺癌患者的5年生存率；而近年來分子靶向藥物索拉非尼的出現(xiàn)更為乳腺癌患者帶來了福音。
　　 索拉非尼

3、(Sorafenib)是首個口服的多激酶抑制劑,靶向作用于腫瘤細胞和腫瘤血管上的絲氨酸/蘇氨酸激酶和受體酪氨酸激酶,是一種多靶點抗腫瘤藥,它對C-RAF、野生型和突變型B-RAF有強效的抑制作用,能抑制C-RAF和B-RAF的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性；它還能抑制血管內(nèi)皮生長因子受體-2(vascularendothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2)、血管內(nèi)皮生長因子-3(VEGFR-3)以及血小

4、板源性生長因子受體-β(platelet-derived growth factorreceptor,PDGFR-β)、FLT3、Ret和c-KIT的酪氨酸激酶的活性,具有雙重抗腫瘤活性,主要用于晚期腎細胞痛的治療。在乳腺癌方面,Bianchi等進行的Ⅱ期多中心非對照臨床研究表明索拉非尼400mg單藥,每天兩次治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌,對總生存率沒有明顯改善,但該研究顯示在使用過一次或多次化療之后的乳腺痛患者身上再使用索拉非尼可以得到令人鼓舞的

5、疾病穩(wěn)定率。因此探討索拉非尼與化療聯(lián)合的生物化療模式成為治療乳腺癌的新的熱點。
　　 表阿霉素直接嵌入DNA堿基對之間,干擾轉(zhuǎn)錄過程,阻止mRNA的形成,從而抑制DNA和RNA的合成。此外,表阿霉素對拓樸異構(gòu)酶Ⅱ也有抑制作用。表阿霉素為一細胞周期非特異性藥物,對多種移植性腫瘤均有效。日本乳腺癌協(xié)會的科學(xué)研究小組的一項研究表明對免疫組化染色后定義為TOP2A陽性和BRCA1陰性的患者給予術(shù)前含表阿霉素的化療方案可以得到更高的病理學(xué)

6、完全緩解率。本研究意在探討索拉非尼聯(lián)合表阿霉素的生物化療模式對乳腺癌MCF-7細胞的聯(lián)合抑制作用,并探討其可能機制,為乳腺癌的綜合治療提供理論基礎(chǔ)。
　　 研究目的：
　　 1.了解乳腺癌MCF-7細胞的生長趨勢,繪制生長曲線
　　 2.了解乳腺癌MCF-7細胞的克隆增值比率,計算克隆形成率
　　 3.了解單藥索拉非尼對MCF-7細胞的生長抑制作用
　　 4.了解單藥表阿霉素對MCF-7細胞的生長

7、抑制作用
　　 5.了解索拉非尼與表阿霉素單藥及聯(lián)合對MCF-7細胞的生長、凋亡、周期的作用
　　 研究方法：
　　 1.了解乳腺癌MCF-7細胞的生長趨勢,繪制生長曲線
　　 ①人乳腺癌細胞MCF-7在含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),3-5天傳代一次,取對數(shù)生長期細胞作為實驗用。
　　 ②取生長良好的MCF-7細胞以1×104/每孔接種于96孔板,每組3個復(fù)孔,分14組,于培養(yǎng)

8、的1～14d每天用MTT比色法檢測3個復(fù)孔的吸光度值A(chǔ),取平均值,以時間為橫坐標(biāo),每日吸光度平均值A(chǔ)值為縱坐標(biāo)繪制細胞的生長曲線。
　　 2 了解乳腺癌MCF-7細胞的克隆增值比率,計算克隆形成率
　　 ①人乳腺癌細胞MCF-7在含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),3-5天傳代一次,取對數(shù)生長期細胞作為實驗用。
　　 ②取生長良好的MCF-7細胞,計數(shù),調(diào)整細胞濃度按300個/孔的濃度接種于6孔板中

9、,設(shè)3個復(fù)孔,置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　 ③于14 d時取出觀察,細胞已形成克隆,棄培養(yǎng)液。常規(guī)固定、姬姆薩染色,清洗,計數(shù)>50個細胞的克隆數(shù)?？寺⌒纬陕?％)=(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100％。
　　 3.了解單藥索拉非尼對MCF-7細胞的生長抑制的作用
　　 ①人乳腺癌細胞MCF-7在含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),3-5天傳代一次,取對數(shù)生長期細胞作為實驗用。
　　 ②采用M

10、TT法分析MCF-7細胞對索拉非尼敏感性:靶細胞均以1×104/ml濃度接種于96孔培養(yǎng)板,100μl/孔,培養(yǎng)過夜后,加入藥物,索拉非尼設(shè)7個濃度梯度,分別為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 μmol/L,每種藥物濃度設(shè)4個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次,并設(shè)不含藥物對照組。分別培養(yǎng)24、48、72 h后,每孔加入20μl MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,每孔加入二甲基亞砜150μl,震蕩器上充分混勻,于自動酶標(biāo)儀490 n

11、m波長下測定A值,計算細胞增殖抑制率。抑制率(％)=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100％,計算50％細胞生長抑制所需的索拉非尼藥物濃度(IC50),確定下一步實驗藥物孵育濃度。
　　 4 了解單藥表阿霉素對MCF-7細胞的生長抑制的作用
　　 ①人乳腺癌細胞MCF-7在含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),3-5天傳代一次,取對數(shù)生長期細胞作為實驗用。
　　 ②采用MTT法分析MCF-7細

12、胞對表阿霉素藥物敏感性:靶細胞均以1×104/ml濃度接種于96孔培養(yǎng)板,100μl/孔,培養(yǎng)過夜后,加入藥物,表阿霉素設(shè)8個濃度梯度,分別為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625μmol/L,每種藥物濃度設(shè)4個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次,并設(shè)不含藥物對照組。分別培養(yǎng)24、48、72h后,每孔加入20 μl MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4h,每孔加入二甲基亞砜150μl,震蕩器上充分混勻,于自動酶標(biāo)儀490 nm波長

13、下測定A值,計算細胞增殖抑制率。抑制率(％)=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100％,計算50％細胞生長抑制所需的表阿霉素藥物濃度(IC50),確定下一步實驗藥物孵育濃度。
　　 5 了解索拉非尼與表阿霉素聯(lián)合對MCF-7細胞的生長、凋亡、周期的作用
　　 ①人乳腺μ細胞MCF-7在含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),3-5天傳代一次,取對數(shù)生長期細胞作為實驗用。
　　 ②根據(jù)索拉非尼及表

14、阿霉素單藥IC50值制定聯(lián)合給藥濃度。根據(jù)索拉非尼單藥及表阿霉素單藥不同時間點作用的IC50值確定以下實驗的作用時間為72h.木實驗索拉非尼單藥給藥濃度定為2、1、0.5μmol/L,表阿霉素單藥給藥濃度定為1、0.5、0.25μmol/ml,聯(lián)合組合濃度交互組合定為(2+1)、(2+0.5)、(2+0.25)、(1+1)、(1+0.5)、(1+0.25)、(0.5+1)、(0.5+0.5)、(0.5+0.25)μmol/L,每種藥物濃

15、度設(shè)3個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次,并設(shè)不含藥物對照組。分別培養(yǎng)72 h后,每孔加入20μl MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,每孔加入二甲基亞砜150 μl,震蕩器上充分混勻,于自動酶標(biāo)儀490 nm波長下測定A值,計算細胞增殖抑制率。抑制率(％)=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100％,金正均法判斷兩藥合用是否具有協(xié)同作用。q值的計算公式:q=EAB/(EA+EB-EAEB)式中EA和EB為各藥單用抑制率,EAB為兩藥合用抑制率。q>1

16、.15為協(xié)同作用,0.85≤q≤1.15為相加作用,q<0.85為拮抗作用。
　　 ③根據(jù)上述實驗所得結(jié)果取q>1.15的聯(lián)合組即索拉非尼2μmol/L+表阿霉素0.5μmol/L濃度進行細胞周期及凋亡檢測和分析。人乳腺痛細胞MCF-7在含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),3-5天傳代一次,取對數(shù)生長期細胞作為實驗用。
　　 細胞分為4組,索拉非尼單藥組2μmol/L,表阿霉素單藥組0.25μmol/L,聯(lián)

17、合組(2.0+0.25)μmol/L,加藥后培養(yǎng)72h,Annexin V-FITC/PI雙染法、流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,PI單染法、流式細胞儀進行細胞周期檢測和分析。實驗重復(fù)3次。
　　 6 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,應(yīng)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。若只有一種影響因素則采用單因素方差分析(one-way ANOVA);兩種因素以上采用析因分析,有交互效應(yīng)時進行多重比較,無交互效應(yīng)時,每種