阿托伐他汀對轉(zhuǎn)化生長因子β-,1-誘導(dǎo)的大鼠肺肌成纖維細(xì)胞分化的影響.pdf

1、目的：本試驗應(yīng)用阿托伐他汀來干預(yù)肺纖維化模型大鼠的肺成纖維細(xì)胞以及由轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的大鼠肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程，觀察該藥對細(xì)胞增殖的影響，以及對肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達(dá)的影響，并應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR技術(shù)測定藥物對細(xì)胞內(nèi)信號蛋白Smad-3mRNA含量的影響，從而了解阿托伐他汀抗大鼠肺纖維化作用，并進一步探究其作用機制。 方法：選用雌性Wistar大鼠(體重1

2、50-170g)分為兩組，每組兩只，試驗組大鼠給予一次性氣管內(nèi)注入博萊霉素溶液(5mg/Kg體重)建立肺纖維化模型，對照組大鼠給予等量生理鹽水。手術(shù)后在原條件下繼續(xù)飼養(yǎng)一周后無菌條件下取鼠肺，應(yīng)用消化法于DMEM培養(yǎng)基中進行成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)，自然法純化，傳代至第四代始，以成纖維細(xì)胞內(nèi)波形蛋白為目標(biāo)對細(xì)胞進行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，同時應(yīng)用形態(tài)學(xué)方法來鑒定細(xì)胞。選取0、0.1、1、5、10μM五個濃度劑量的阿托伐他汀分別對試驗組細(xì)胞進行干預(yù)

3、，應(yīng)用MTT法連續(xù)七天測定細(xì)胞增殖情況，繪制生長曲線；對照組、試驗組細(xì)胞又分別分出無干預(yù)因素組、TGF-β1單獨干預(yù)組、TGF-β1聯(lián)合不同濃度藥物干預(yù)組，仍然應(yīng)用MTT法觀察藥物對細(xì)胞增殖的抑制情況；SP法對細(xì)胞進行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，觀察藥物對肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA表達(dá)的影響；熒光定量RT-PCR技術(shù)測定藥物對細(xì)胞內(nèi)信號蛋白Smad3mRNA含量的影響。結(jié)果： 1大鼠肺成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及純化經(jīng)純化傳代后，成纖維細(xì)胞形

4、態(tài)單一，胞體較大，均大致呈梭形，均有細(xì)長纖維絲。胞漿清晰。與博萊霉素試驗組細(xì)胞相比，生理鹽水對照組細(xì)胞胞體略小，開始時生長較緩慢，隨著代數(shù)增高生長逐漸變快。而博萊霉素組細(xì)胞胞體較大，形狀也不如鹽水組細(xì)胞規(guī)則，有一些胞突，核漿比例高，生長速度明顯快于對照組。 2成纖維細(xì)胞的鑒定形態(tài)學(xué)鑒定：所培養(yǎng)細(xì)胞在光鏡下呈典型的梭形，胞體狹長、透亮，胞漿豐富，胞膜清晰。經(jīng)波形蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色(SP法)鑒定，陽性細(xì)胞計數(shù)，實驗組及對照組成纖維

5、細(xì)胞均可達(dá)95％以上。 3阿托伐他汀對纖維化大鼠肺成纖維細(xì)胞增殖的影響應(yīng)用重復(fù)測量設(shè)計資料方差分析可知，各劑量組中不同干預(yù)天數(shù)所測得的OD值之間存在顯著差異(P＜0.01)。各時間點所測0D值與不同用藥物劑量之間存在交互作用(P＜0.01)。各劑量組對細(xì)胞的抑制作用之間存在顯著差別(P＜0.01)。 4阿托伐他汀對TGF-B1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞增殖的影響無論是博萊霉素實驗組還是生理鹽水對照組的藥物因素對肺成纖維細(xì)胞增殖均

6、有影響(P＜0.01)，事后兩兩比較顯示兩組細(xì)胞中除無干預(yù)因素組與1μM藥物組、FGF-β1單獨誘導(dǎo)組與0.1μM藥物組OD值之間無差異(P＞0.05)之外，其余各組兩兩互比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。區(qū)組因素對細(xì)胞OD值有影響，實驗組OD值較對照組要高(P＜0.01)。 5阿托伐他汀對TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志性產(chǎn)物α-SMA表達(dá)的影響免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示無論對于實驗組還是對照組，藥物因素對α-SMA的表達(dá)量

7、(灰度值)都有影響(P＜0.01)。各劑量組之間α-SMA的表達(dá)量差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。區(qū)組因素對α-SMA的表達(dá)量有影響，實驗組α-SMA的表達(dá)量較對照組要高(P＜0.01)。 6阿托伐他汀對TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺肌成纖維細(xì)胞內(nèi)信號蛋白Smad3mRNA表達(dá)量的影響實時熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示：無論是博萊霉素實驗組還是生理鹽水對照組的藥物因素對Smad3mRNA表達(dá)量均有影響(P＜0.01)，事后兩兩比較顯示

8、：無干預(yù)因素組與5μM藥物組、0.1μM與TGF-β1單獨組、1μM與0.1μM藥物組Smad3mRNA表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。實驗組與對照組細(xì)胞Smad3mRNA表達(dá)量相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 結(jié)論：1肺纖維化大鼠肺組織內(nèi)成纖維細(xì)胞與正常肺組織內(nèi)成纖維細(xì)胞相比具有表型輕度分化和增殖速度快的特點。2阿托伐他汀能夠抑制肺纖維化大鼠肺成纖維細(xì)胞的增殖。3該藥同時能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞的分