雜色鮑高溫和缺氧應(yīng)激下若干熱激反應(yīng)基因的研究.pdf

1、熱激反應(yīng)相關(guān)基因?qū)C(jī)體在高溫及缺氧應(yīng)激條件下啟動(dòng)熱休克反應(yīng)具有重要作用。本研究通過(guò)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)查找并結(jié)合SMART-RACE技術(shù)成功克隆得到5條熱休克及免疫調(diào)控相關(guān)基因：熱休克轉(zhuǎn)錄因子1（heat shock transcriptional factor1，HSF1）、熱休克因子結(jié)合蛋白1（heat shock factor binding protein1，HSBP1）、熱休克蛋白90（heat shock protei

2、n90，HSP90）、同種移植炎癥因子1（allograft inflammatory factor1, AIF-1）和紫色酸性磷酸酯酶（Purple acid phosphatase, PAP），并分別命名為HdHSF1、HdHSBP1、HdHSP90、HdAIF-1和HdPAP。采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qPCR）技術(shù)分析雜色鮑若干熱激反應(yīng)基因在高溫和缺氧應(yīng)激過(guò)程中的變化。通過(guò)培養(yǎng)雜色鮑血細(xì)胞，運(yùn)用RNAi技術(shù)對(duì)HdHSF1干擾后，

3、檢測(cè)其它熱休克相關(guān)基因的表達(dá)情況并作分析。主要的研究結(jié)果如下：（1）HdHSF1的cDNA全長(zhǎng)為2134 bp，編碼515個(gè)氨基酸。qRT-PCR顯示HdHSF1在鰓中表達(dá)量最高，在血淋巴中表達(dá)量最低。HdHSF1在高溫應(yīng)激后的96 h和192 h的鰓組織中表達(dá)量顯著上調(diào)，而在血淋巴中則當(dāng)溫度升至28℃及31℃下0 h和192 h均出現(xiàn)表達(dá)量顯著性上調(diào)（p<0.05）。同時(shí)，在缺氧應(yīng)激下，鰓中HdHSF1在缺氧4 h、24 h和96 h

4、均出現(xiàn)顯著性上調(diào)表達(dá)，而在血淋巴中直到96 h才出現(xiàn)表達(dá)量顯著性上調(diào)。高溫和缺氧聯(lián)合應(yīng)激情況下，鰓中HdHSF1的表達(dá)量在暴露4 h、24 h和96 h均顯著高于對(duì)照組，而血淋巴中則是在應(yīng)激的0 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組 HdHSF1的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。通過(guò) RNAi技術(shù)對(duì)HdHSF1進(jìn)行表達(dá)抑制，實(shí)驗(yàn)組HdHSF1的表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。
　?。?）HdHSBP1的cDNA全序列為809 bp，編碼75個(gè)氨基酸。HdHSB

5、P1在血淋巴中的表達(dá)量最高。自熱應(yīng)激初始階段血淋巴中該基因的表達(dá)量就出現(xiàn)顯著性下調(diào)（p<0.05）。而鰓中HdHSBP1的表達(dá)量在熱應(yīng)激后也出現(xiàn)顯著性下調(diào)，到24 h則恢復(fù)到對(duì)照組水平，96 h和192 h該基因的表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組水平。此外，在血淋巴中所有熱應(yīng)激時(shí)相的HdHSBP1的表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組。缺氧應(yīng)激條件下鰓中HdHSBP1的表達(dá)量自24 h到192 h均顯著低于對(duì)照組（p<0.05）。高溫和缺氧聯(lián)合應(yīng)激情況下，Hd

6、HSBP1在暴露4 h時(shí)的鰓中表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。而在血淋巴中，0 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組顯著低于對(duì)照組，到了4 h時(shí) HdHSBP1的表達(dá)量又顯著性高于對(duì)照組。在 HdHSF1的表達(dá)受抑制情況下，實(shí)驗(yàn)組HdHSBP1的表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組。
　?。?）HdHSP90的cDNA全長(zhǎng)2592 bp，編碼728氨基酸。HdHSP90在消化道和粘液腺中表達(dá)量最高。當(dāng)溫度升至28℃及31℃應(yīng)激下0 h和192 h，HdHSP90在鰓

7、中的表達(dá)量顯著上調(diào)，在血淋巴中則在31℃下0 h和4 h出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)（p<0.05）。缺氧應(yīng)激下，鰓中HdHSP90表達(dá)量則在4 h、24 h和96 h顯著上調(diào)表達(dá)，血淋巴中到192 h出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)（p<0.05）。高溫和缺氧聯(lián)合應(yīng)激情況下，鰓中HdHSP90在應(yīng)激4 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組（p<0.05），血淋巴中無(wú)顯著性差異。在HdHSF1的表達(dá)受抑制情況下，實(shí)驗(yàn)組HdHSP90的表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照和陰性對(duì)照。

8、　?。?）HdAIF-1的cDNA全長(zhǎng)942 bp，編碼151個(gè)氨基酸。HdAIF-1基因在所檢測(cè)的7個(gè)組織均有表達(dá)，其中在血淋巴中的表達(dá)量最高。高溫應(yīng)激下，雜色鮑鰓中HdAIF-1的表達(dá)量顯著上調(diào)（p<0.05），并在溫度升至31℃時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高。在96 h時(shí)，血淋巴和肝胰腺中的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（p<0.05），血淋巴在192 h時(shí)仍顯著高于對(duì)照組（p<0.05）。缺氧應(yīng)激24 h，HdAIF-1在鰓中表達(dá)量顯著下調(diào)（p<0.0

9、5），96 h恢復(fù)到正常水平，到了192 h，缺氧組的HdAIF-1表達(dá)量又顯著上升（p<0.05）。
　?。?）HdPAP cDNA全長(zhǎng)1215 bp，編碼322個(gè)氨基酸。qRT-PCR顯示，HdPAP在檢測(cè)的雜色鮑各組織中均有表達(dá)，其中在血淋巴和肝胰腺的表達(dá)量顯著高于其他各組織。高溫應(yīng)激下，HdPAP在血淋巴、肝胰腺和鰓中均出現(xiàn)不同程度的表達(dá)抑制。缺氧應(yīng)激4 h血淋巴中HdPAP顯著低于對(duì)照組，24 h恢復(fù)到正常水平，96 h

10、顯著高于對(duì)照組，到192 h又恢復(fù)到正常水平。
　　從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選獲得雜色鮑熱休克相關(guān)蛋白：熱休克蛋白22（Heat shock protein22, HSP22）、熱休克蛋白26（Heat shock protein26, HSP26）、熱休克蛋白40（Heat shock protein40, HSP40）、熱休克蛋白60（Heat shock protein60, HSP60）、熱休克蛋白70（Heat shock p

11、rotein70, HSP70）、熱休克蛋白105（Heat shock protein105, HSP105）和熱激誘導(dǎo)磷酸化因子1（Stress induced-phosphoprotein1, Sip1），依次命名為HdHSP22、HdHSP26、HdHSP40、HdHSP60、HdHSP70、HdHSP105和HdSip1。高溫、缺氧以及高溫和缺氧聯(lián)合應(yīng)激情況下，雜色鮑鰓中上述基因表達(dá)量也出現(xiàn)了不同程度的表達(dá)上調(diào)情況。在對(duì)HdH