化學(xué)激活在小鼠生精細(xì)胞體外受精中的應(yīng)用.pdf

1、第一部分小鼠單倍體精子細(xì)胞顯微注射方法學(xué)研究
　　目的:探討改良持卵針的顯微操作系統(tǒng)在小鼠精子細(xì)胞體外授精中的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法:通過(guò)反復(fù)鍛燒將常規(guī)持卵針制作成喇叭形開(kāi)口狀,制成改良持卵針,輔以獨(dú)特的顯微注射操作手法,對(duì)小鼠生精細(xì)胞體外培養(yǎng)所獲單倍體圓形精子進(jìn)行卵胞漿內(nèi)顯微注射(ROSI),計(jì)算ROSI后30 min昆明小白鼠卵母細(xì)胞的存活數(shù)和存活率,并與常規(guī)窄口持卵針行ROSI后的卵母細(xì)胞存活率進(jìn)行比較。
　　結(jié)果

2、:分別采用常規(guī)和改良后的持卵針進(jìn)行小鼠ROSI,每種方法各注射320個(gè)卵母細(xì)胞。改良持卵針組ROSI后30 min的卵母細(xì)胞存活率顯著高于未改進(jìn)持卵針組(P<0.05)。
　　結(jié)論:改良持卵針制備簡(jiǎn)單,易于操作,ROSI后卵母細(xì)胞存活率高,且不需依賴piezo系統(tǒng),在小鼠單倍體精子細(xì)胞體外受精的研究中有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　第二部分化學(xué)激活在小鼠圓形精子體外受精中的應(yīng)用
　　目的:通過(guò)對(duì)生精細(xì)胞體外培養(yǎng)所獲圓形精子

3、顯微注射后的小鼠卵母細(xì)胞進(jìn)行單一和聯(lián)合化學(xué)激活,尋找小鼠圓形精子體外受精的最佳激活方案。
　　方法:選取乙醇(ethanol,EH)、鈣離子載體A23187(calcium ionophore A23187, CIA)、離子霉素(ionomycin,Ion)、氯化鍶(strontium chloride,SrCl2)、放線菌酮(cycloheximide,CHX)及6-二甲基苯胺嘌呤(6-dimethylaminopurine,6

4、-DMAP)作為外源性化學(xué)激活劑,采用不同濃度的單一化學(xué)激活劑對(duì)ROSI后的卵母細(xì)胞進(jìn)行不同作用時(shí)間激活,觀察其受精率、卵裂率和桑囊胚形成率。根據(jù)激活不同的途徑,聯(lián)合兩種最佳激活濃度和激活時(shí)間的單一激活劑對(duì)ROSI后的卵母細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合激活,比較不同聯(lián)合方案對(duì)卵母細(xì)胞的激活效果;并以成年小鼠睪丸內(nèi)圓形精子ROSI作為對(duì)照,比較體內(nèi)精子細(xì)胞和體外培養(yǎng)精子細(xì)胞的受精能力及胚胎發(fā)育潛能。
　　結(jié)果:(1)單一激活時(shí),各激活劑的最佳方案分別

5、為①乙醇:7％、6 min;②CIA:5μmol/L、5 min;③Ion:5μmol/L、5 min;④6-DMAP:2 mmol/L、2 h;⑤SrCl2:10 mmol/L、1.5 h;⑥CHX:10μg/mL、1.5 h,其中10 mmol/L SrCl2作用1.5 h激活效果最佳,顯著優(yōu)于 CHX方案,但與其它各組無(wú)顯著性差異;(2)聯(lián)合激活時(shí),乙醇+6-二甲基苯胺嘌呤組桑囊胚率(29.63%)顯著高于其它各組,以及除SrCl

6、2以外所有單一激活方案(P<0.05),為最佳聯(lián)合激活方案;(3)對(duì)成年小鼠睪丸中圓形精子 ROSI后的卵母細(xì)胞進(jìn)行乙醇+6-二甲基苯胺嘌呤激活后,其正常受精率、卵裂率及桑囊胚率與體外培養(yǎng)所獲圓形精子間均無(wú)顯著性差異。
　　結(jié)論:單一激活方案中10 mmol/L SrCl2單獨(dú)作用1.5 h,聯(lián)合方案中7%EH作用6 min+2 mmol/L6-DMAP作用2 h對(duì)體外培養(yǎng)所獲圓形精子ROSI后的卵母細(xì)胞激活效果最佳;體外培養(yǎng)所獲