MafA基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在人肝癌細(xì)胞HePG-2中的表達(dá)和作用.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 胰島素基因轉(zhuǎn)錄由胰島素啟動(dòng)子引發(fā)，在這個(gè)過程中有許多轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子參與，通過提高體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的產(chǎn)量，從而提高胰島素基因的轉(zhuǎn)錄是一種可能有效的途徑。肌腱膜纖維肉瘤腫瘤基因同系物A（Mus musculus v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family，protein A，MafA）是最近分離出來的轉(zhuǎn)錄因子，具有胰腺β細(xì)胞特異性，對于胰腺生長和β細(xì)胞（產(chǎn)生胰島素

2、的細(xì)胞）的分化及維持正常的β細(xì)胞功能至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建可以表達(dá)小鼠MafA基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染入人肝癌細(xì)胞HePG-2，觀察MafA基因在細(xì)胞中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究MafA功能及其作用機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法: 1.提取小鼠胰腺總RNA，經(jīng)RT-PCR獲得MafA基因片段，并在兩端分別引入HindⅢ和SalⅠ酶切位點(diǎn)，重組至有增強(qiáng)綠色熒光蛋白標(biāo)記的真核表達(dá)載體pEGFP-N2，pEGFP-C1中。 2

3、.用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞HePG-2細(xì)胞中，再通過三種不同葡萄糖濃度刺激已轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞，用熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)，通過RT-PCR檢測MafA基因和insulinⅡ基因的表達(dá)，通過WesternBlot檢測融合蛋白EGFP-MafA的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1.通過RT-PCR鑒定重組質(zhì)粒時(shí)，在1080bp獲取了明亮的條帶。基因測序測得所獲得得基因序列與GENEBANK報(bào)道MafA基因序列一致。 2.轉(zhuǎn)

4、入重組質(zhì)粒的細(xì)胞有綠色熒光蛋白表達(dá)。Western Blot檢測重組質(zhì)粒表達(dá)時(shí)在70KD左右可見明顯的條帶。 3.通過RT-PCR檢測insulinⅡ表達(dá)時(shí)，沒有得到目的條帶。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論: 1.利用帶有綠色熒光蛋白序列為報(bào)告基因的pEGFP-N2和pEGFP-C1，成功構(gòu)建了可表達(dá)融合基因EGFP-MafA的真核表達(dá)質(zhì)粒。pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA。 2.pEGFP-N2/Ma