MafA基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及其在人肝癌細胞HePG-2中的表達和作用.pdf

1、實驗?zāi)康? 胰島素基因轉(zhuǎn)錄由胰島素啟動子引發(fā)，在這個過程中有許多轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子參與，通過提高體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的產(chǎn)量，從而提高胰島素基因的轉(zhuǎn)錄是一種可能有效的途徑。肌腱膜纖維肉瘤腫瘤基因同系物A（Mus musculus v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family，protein A，MafA）是最近分離出來的轉(zhuǎn)錄因子，具有胰腺β細胞特異性，對于胰腺生長和β細胞（產(chǎn)生胰島素

2、的細胞）的分化及維持正常的β細胞功能至關(guān)重要。本實驗擬構(gòu)建可以表達小鼠MafA基因的真核表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染入人肝癌細胞HePG-2，觀察MafA基因在細胞中的表達，為進一步研究MafA功能及其作用機制奠定實驗基礎(chǔ)。 實驗方法: 1.提取小鼠胰腺總RNA，經(jīng)RT-PCR獲得MafA基因片段，并在兩端分別引入HindⅢ和SalⅠ酶切位點，重組至有增強綠色熒光蛋白標記的真核表達載體pEGFP-N2，pEGFP-C1中。 2

3、.用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至人肝癌細胞HePG-2細胞中，再通過三種不同葡萄糖濃度刺激已轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HepG2細胞，用熒光顯微鏡觀察熒光表達，通過RT-PCR檢測MafA基因和insulinⅡ基因的表達，通過WesternBlot檢測融合蛋白EGFP-MafA的表達。 實驗結(jié)果: 1.通過RT-PCR鑒定重組質(zhì)粒時，在1080bp獲取了明亮的條帶?；驕y序測得所獲得得基因序列與GENEBANK報道MafA基因序列一致。 2.轉(zhuǎn)

4、入重組質(zhì)粒的細胞有綠色熒光蛋白表達。Western Blot檢測重組質(zhì)粒表達時在70KD左右可見明顯的條帶。 3.通過RT-PCR檢測insulinⅡ表達時，沒有得到目的條帶。 實驗結(jié)論: 1.利用帶有綠色熒光蛋白序列為報告基因的pEGFP-N2和pEGFP-C1，成功構(gòu)建了可表達融合基因EGFP-MafA的真核表達質(zhì)粒。pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA。 2.pEGFP-N2/Ma