rBTI上調(diào)PTEN表達(dá)抑制HepG2細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、蛋白酶抑制劑是對蛋白酶有專一抑制作用的一類小分子化合物或多肽的總稱，普遍存在于植物、動物和微生物中。蛋白酶抑制劑具有維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，抗HIV、抗蟲和抗真菌以及抑制腫瘤細(xì)胞增殖等活性。蕎麥胰蛋白酶抑制劑(BTI)來自蕎麥種子，屬于Potato I型蛋白酶抑制劑家族，由69個氨基酸組成，分子量為7.9 kDa。前期研究結(jié)果表明，重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑(rBTI)能抑制某些腫瘤細(xì)胞增殖，如EC9706、K562、Hep G2、Hela等，

2、而對正常肝細(xì)胞HL7702沒有影響。但rBTI抑制腫瘤細(xì)胞增殖的具體分子機制和靶點還不明確。本文以rBTI為材料，探究其對Hep G2細(xì)胞增殖抑制的可能分子機制。研究內(nèi)容主要圍繞三個方面開展：
　　1.采用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測了rBTI對Hep G2細(xì)胞增殖以及細(xì)胞周期的影響，免疫熒光及Western印跡法檢測了PTEN和p-PTEN的亞細(xì)胞定位及蛋白表達(dá)的變化，采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)及Western印跡

3、法檢測了周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，旨在探究PTEN和p-PTEN在rBTI抑制Hep G2細(xì)胞增殖和周期阻滯中的作用。結(jié)果表明，rBTI能顯著抑制Hep G2細(xì)胞增殖，將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，并呈時間和劑量依賴性；rBTI作用于Hep G2細(xì)胞后，可顯著上調(diào)PTEN和p-PTEN的表達(dá)，同時發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的p-PTEN分布于細(xì)胞核中，能與核仁共定位；周期相關(guān)蛋白檢測表明，細(xì)胞內(nèi)p53、p21轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均增加。由此說明，rBTI通過上

4、調(diào)PTEN表達(dá)，使得細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，進(jìn)而抑制Hep G2細(xì)胞增殖。
　　2.采用qRT-PCR法檢測rBTI對PTEN基因表達(dá)的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)ROS的變化情況，通過Western blot法檢測rBTI和rBTI聯(lián)合ROS清除劑NAC作用于Hep G2細(xì)胞后，細(xì)胞中PTEN、p-PTEN的變化情況，旨在探究PTEN變化情況與細(xì)胞內(nèi)ROS之間的關(guān)系。結(jié)果表明，rBTI作用于細(xì)胞后，PTEN基因

5、表達(dá)和ROS生成增加；Western blot結(jié)果表明，rBTI使細(xì)胞中PTEN和p-PTEN表達(dá)上調(diào)；而當(dāng)用NAC作用Hep G2細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平有所下調(diào)，同時細(xì)胞內(nèi)PTEN和p-PTEN的表達(dá)也隨之下調(diào)。因此，我們得出結(jié)論，細(xì)胞內(nèi)PTEN表達(dá)升高由rBTI誘導(dǎo)的ROS所介導(dǎo)。
　　3.采用MTT法檢測rBTI和自噬抑制劑3-MA對Hep G2細(xì)胞增殖的影響，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和Western blot檢測rBTI以及rBTI

6、聯(lián)合磷酸酶抑制劑phen對EGFP-LC3分布以及自噬相關(guān)蛋白LC3和p62表達(dá)的影響，通過Western blot檢測rBTI以及rBTI
　　聯(lián)合phen對PI3K/AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明，rBTI抑制Hep G2細(xì)胞增殖是通過自噬誘發(fā)的；當(dāng)rBTI作用于已轉(zhuǎn)染pEGFP-LC3質(zhì)粒的Hep G2細(xì)胞后，細(xì)胞中EGFP-LC3蛋白表達(dá)上調(diào)，并且LC3的聚集狀態(tài)發(fā)生明顯變化，胞質(zhì)中的LC3以點狀形式

7、存在；Western blot結(jié)果表明，rBTI作用于Hep G2細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)LC3 II/I比值升高、自噬底物p62表達(dá)降低，同時發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白p-AKT和p-mTOR表達(dá)降低；與rBTI單獨處理組相比，rBTI和phen聯(lián)合作用于細(xì)胞后，細(xì)胞中EGFP-LC3蛋白表達(dá)有所下調(diào)，Western blot結(jié)果中LC3 II/I比值下調(diào)、自噬底物p62表達(dá)有所升高，并且發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/mTOR信號通

8、路相關(guān)蛋白p-AKT、p-mTOR表達(dá)有所恢復(fù)。因此，推測rBTI通過上調(diào)PTEN的表達(dá)，抑制PI3K/AKT通路，從而誘導(dǎo)Hep G2細(xì)胞發(fā)生自噬。
　　綜上所述，rBTI作用于Hep G2細(xì)胞后，使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，進(jìn)而抑制Hep G2細(xì)胞的增殖；rBTI刺激細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生；升高的ROS上調(diào)抑癌蛋白PTEN表達(dá)，進(jìn)而影響PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。這些研究內(nèi)容為從分子水平上了解該類蛋白質(zhì)抑制