重組腺病毒ALR的構(gòu)建及過表達(dá)ALR在軟脂酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪變性中的作用.pdf

1、背景：近年來非酒精性脂肪肝病（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）發(fā)病率明顯上升，西方發(fā)達(dá)國(guó)家的年發(fā)病率高達(dá)20％-40%，在中國(guó)發(fā)病僅次于病毒性肝病，且有極大可能發(fā)展至肝硬化、肝癌以及肝功能衰竭，危及生命。報(bào)道顯示，與普通人群相比，脂肪肝患者的心血管疾病死亡率較高。因此，NAFLD是人類健康的一大嚴(yán)重威脅。且NAFLD的臨床表現(xiàn)輕微，無特異性表現(xiàn)，診斷多依賴實(shí)驗(yàn)室檢查，也無批準(zhǔn)的單藥治療方案

2、，因此對(duì)NAFLD的發(fā)病機(jī)制進(jìn)一步研究以尋找有效的分子標(biāo)志物用于NAFLD的早期篩查，并發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)予以針對(duì)性治療，這對(duì)提高早期診斷率及改善預(yù)后意義重大。
　　肝再生增強(qiáng)因子（augmenter of liver regeneration,ALR），首次發(fā)現(xiàn)是定位于肝細(xì)胞漿，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)免疫，逆轉(zhuǎn)肝臟纖維化等作用的一種非特異性細(xì)胞因子。ALR在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有三種分子片段：15KD、21KD和23KD。15KD

3、是23KD的C′末端片斷，即15KD ALR無信號(hào)肽序列，目前研究23KD ALR主要是在線粒體功能活動(dòng)發(fā)揮作用。已有研究表明特異性敲除小鼠23KD的ALR基因后，肝臟的脂肪性肝炎及肝癌的發(fā)病率明顯增加，而且在NAFLD的病人肝組織標(biāo)本檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)23KD ALR的表達(dá)較正常人肝是下調(diào)的，說明23 KD ALR在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，而15KD背景：近年來非酒精性脂肪肝病（Non-alcoholic fatty liver d

4、isease,NAFLD）發(fā)病率明顯上升，西方發(fā)達(dá)國(guó)家的年發(fā)病率高達(dá)20%-40%，在中國(guó)發(fā)病僅次于病毒性肝病，且有極大可能發(fā)展至肝硬化、肝癌以及肝功能衰竭，危及生命。報(bào)道顯示，與普通人群相比，脂肪肝患者的心血管疾病死亡率較高。因此，NAFLD是人類健康的一大嚴(yán)重威脅。且NAFLD的臨床表現(xiàn)輕微，無特異性表現(xiàn)，診斷多依賴實(shí)驗(yàn)室檢查，也無批準(zhǔn)的單藥治療方案，因此對(duì)NAFLD的發(fā)病機(jī)制進(jìn)一步研究以尋找有效的分子標(biāo)志物用于NAFLD的早期篩查

5、，并發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)予以針對(duì)性治療，這對(duì)提高早期診斷率及改善預(yù)后意義重大。
　　肝再生增強(qiáng)因子（augmenter of liver regeneration,ALR），首次發(fā)現(xiàn)是定位于肝細(xì)胞漿，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)免疫，逆轉(zhuǎn)肝臟纖維化等作用的一種非特異性細(xì)胞因子。ALR在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有三種分子片段：15KD、21KD和23KD。15KD是23KD的C′末端片斷，即15KD ALR無信號(hào)肽序列，目前研究23KD ALR主

6、要是在線粒體功能活動(dòng)發(fā)揮作用。已有研究表明特異性敲除小鼠23KD的ALR基因后，肝臟的脂肪性肝炎及肝癌的發(fā)病率明顯增加，而且在NAFLD的病人肝組織標(biāo)本檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)23KD ALR的表達(dá)較正常人肝是下調(diào)的，說明23KD ALR在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，而15KD ALR作為23KDALR的剪切片段，目前國(guó)內(nèi)外研究中暫無報(bào)道其在NAFLD中的生物學(xué)作用。因此，本實(shí)驗(yàn)主要構(gòu)建重組15KD ALR腺病毒及探討過表達(dá)ALR對(duì)軟脂酸誘導(dǎo)H

7、epG2細(xì)胞脂肪變性的作用，為NAFLD的診治提供新的思路。
　　本研究包括兩個(gè)部分：
　　第一部分、重組Ad-mALR和Ad-hALR的構(gòu)建和鑒定
　　目的：重組腺病毒含肝再生增強(qiáng)因子（ALR）基因的構(gòu)建。
　　方法：基因重組法構(gòu)建重組穿梭載體（pAdTrack-TO4-mALR和pAdTrack-TO4-hALR）,重組腺病毒（Ad-GFP-mALR和Ad-GFP-hALR）采用同源重組法構(gòu)建,4輪擴(kuò)增后獲得

8、高低度重組腺病毒。感染L02細(xì)胞，通過熒光蛋白的表達(dá)了解其感染率，ALR蛋白表達(dá)情況和其增殖活性則通過Western Blotting法和CCK-8法檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.重組腺病毒（Ad-GFP-mALR和Ad-GFP-hALR）被構(gòu)建成功。
　　2.重組腺病毒（Ad-GFP-mALR和 Ad-GFP-hALR）能高效感染并穩(wěn)定表達(dá)于L02細(xì)胞。
　　3.與非感染組和空載病毒組相比，過表達(dá)ALR均能促進(jìn)L

9、02細(xì)胞的增殖。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建重組腺病毒Ad-GFP-mALR和Ad-GFP-hALR,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)15KD ALR對(duì)L02細(xì)胞具有促增殖作用。
　　第二部分、過表達(dá)ALR在軟脂酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪變性中的作用
　　目的：觀察過表達(dá)15KD ALR在軟脂酸(palmitic acid，PA)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪變性的作用，并簡(jiǎn)要探討其機(jī)制。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)分為5組：未感染腺病毒且無PA處理的HepG

10、2細(xì)胞組（G2-NC-No infection）,感染空載病毒無PA的HepG2細(xì)胞組（G2-Ad-GFP-NC）,感染空載病毒有PA的HepG2細(xì)胞組（G2-Ad-GFP-PA），感染Ad-GFP-hALR無PA的HepG2細(xì)胞組（G2-Ad-GFP-hALR-NC）,感染Ad-GFP-hALR有PA的HepG2細(xì)胞組（G2-Ad-GFP-hALR-PA）。甘油三酯（Triglyceride,TG）酶法和尼羅紅染色法定量和定性檢測(cè)胞內(nèi)

11、脂滴儲(chǔ)積情況，Real Time-PCR和Western blotting法被應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)固醇類調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白-1（SREBP-1），脂肪分化相關(guān)蛋白（ADRP）和過氧化物酶體增殖物激活受體-α（PPAR-α）的檢測(cè)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率，Western Blotting法檢測(cè)MAPK通路相關(guān)蛋白。
　　結(jié)果：
　　1.與對(duì)照組G2-NC-No infection、 G2-Ad-GFP-NC、G2-Ad-GFP-hALR-

12、NC相比，實(shí)驗(yàn)組G2-Ad-GFP-PA的TG的測(cè)定是明顯增加的，脂滴的紅色熒光強(qiáng)度是顯著增強(qiáng)的。而與 G2-Ad-GFP-PA組相比，過表達(dá)ALR（G2-Ad-GFP-hALR-PA組）后，細(xì)胞內(nèi)的TG及脂滴的紅色熒光強(qiáng)度明顯下調(diào)。
　　2.與對(duì)照組G2-NC-No infection、G2-Ad-GFP-NC、G2-Ad-GFP-hALR-NC相比，實(shí)驗(yàn)組G2-Ad-GFP-PA中SREBP-1、PPAR-α,ADRP的mRN

13、A及蛋白的表達(dá)均顯著增加。與G2-Ad-GFP-PA組相比，過表達(dá)ALR（G2-Ad-GFP-hALR-PA組）后，胞內(nèi)SREBP-1、PPAR-α,ADRP的mRNA及蛋白表達(dá)較實(shí)驗(yàn)組G2-Ad-GFP-PA下調(diào)。
　　3.與對(duì)照組G2-NC-No infection、G2-Ad-GFP-NC、G2-Ad-GFP-hALR-NC相比，實(shí)驗(yàn)組G2-Ad-GFP-PA中的凋亡率是明顯增加的。但與G2-Ad-GFP-PA組比較，過表達(dá)

14、ALR（G2-Ad-GFP-hALR-PA組）后HepG2細(xì)胞的凋亡率明顯降低。
　　4.與對(duì)照組G2-NC-No infection、G2-Ad-GFP-NC、G2-Ad-GFP-hALR-NC相比，實(shí)驗(yàn)組G2-Ad-GFP-PA中的磷酸化蛋白p-jnk、p-p42/44、p-p38相對(duì)表達(dá)明顯增加。但與G2-Ad-GFP-PA組比較，過表達(dá)ALR（G2-Ad-GFP-PA）組中磷酸化蛋白p-jnk、p-p42/44、p-p38

15、相對(duì)表達(dá)明顯下調(diào)。
　　PPAR-α,ADRP的mRNA及蛋白的表達(dá)均顯著增加。與G2-Ad-GFP-PA組相比，過表達(dá)ALR（G2-Ad-GFP-hALR-PA組）后，胞內(nèi)SREBP-1、PPAR-α,ADRP的mRNA及蛋白表達(dá)較實(shí)驗(yàn)組G2-Ad-GFP-PA下調(diào)。
　　3.與對(duì)照組G2-NC-No infection、G2-Ad-GFP-NC、G2-Ad-GFP-hALR-NC相比，實(shí)驗(yàn)組G2-Ad-GFP-PA中的凋

16、亡率是明顯增加的。但與G2-Ad-GFP-PA組比較，過表達(dá)ALR（G2-Ad-GFP-hALR-PA組）后HepG2細(xì)胞的凋亡率明顯降低。
　　4.與對(duì)照組G2-NC-No infection、G2-Ad-GFP-NC、G2-Ad-GFP-hALR-NC相比，實(shí)驗(yàn)組G2-Ad-GFP-PA中的磷酸化蛋白p-jnk、p-p42/44、p-p38相對(duì)表達(dá)明顯增加。但與G2-Ad-GFP-PA組比較，過表達(dá)ALR（G2-Ad-GFP-

17、PA）組中磷酸化蛋白p-jnk、p-p42/44、p-p38相對(duì)表達(dá)明顯下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.軟脂酸能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的脂肪變性。
　　2.過表達(dá)ALR可減輕PA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的脂滴儲(chǔ)積。
　　3.過表達(dá)ALR可降低脂肪合成代謝中關(guān)鍵酶（SREBP-1、PPAR-α、ADRP）的表達(dá)。
　　4.過表達(dá)ALR可減少PA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡的發(fā)生。
　　5.過表達(dá)ALR可抑制MAPK通路中