類豬圓環(huán)病毒因子P1Cap蛋白部分基因序列的原核表達(dá)及其間接ELISA的建立與應(yīng)用.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，是圓環(huán)病毒屬的代表種，分為PCV1和PCV2兩個(gè)血清型。其中PCV2可引起多種疾病并嚴(yán)重導(dǎo)致豬群產(chǎn)生免疫抑制，從而容易繼發(fā)和并發(fā)其他傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 本實(shí)驗(yàn)室在診斷PCV2的過程中，從患PMWS豬血清中分離到2株類PCV2因子（暫定P1和P2）。其中的P1因子全長648個(gè)核苷酸，部分與PCV2具有高度的同源性。雖然現(xiàn)

2、在對P1因子生物學(xué)特性的研究上有了許多進(jìn)展，但對其在豬群中的流行情況尚不清楚。因此通過表達(dá)P1因子特異的pCap（partial Cap）蛋白建立間接ELISA對調(diào)查其在豬群中傳播范圍和臨床診斷有重要意義。
　　 1.類豬圓環(huán)病毒因子P13pCap串聯(lián)蛋白原核表達(dá)和優(yōu)化軟件分析表明，P1基因組的371位缺失了對應(yīng)于PCV2反向互補(bǔ)序列461位的堿基A。本次實(shí)驗(yàn)研究的pCap基因是P1因子370位到495位的核苷酸序列。設(shè)計(jì)引物將

3、含有不同酶切位點(diǎn)的三個(gè)重復(fù)序列經(jīng)PCR擴(kuò)增后，連接到pET-28a(+)載體中。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET-28a-3pCap轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到分子量為14.7kDa的融合蛋白。最佳誘導(dǎo)條件為:37℃條件下，搖菌至OD值為0.4～0.6后加入IPTG至終濃度為1.0mM，誘導(dǎo)8h后目的蛋白的表達(dá)量最高。Western blotting結(jié)果表明，誘導(dǎo)出的蛋白可以跟P1因子兔高免血清發(fā)生特異性反應(yīng)。表明P1因子三

4、個(gè)重復(fù)的pCap基因編碼的串聯(lián)蛋白原核表達(dá)成功。
　　 2.基于類豬圓環(huán)病毒因子P13pCap串聯(lián)蛋白的間接ELISA的建立將3pCap串聯(lián)蛋白包被酶標(biāo)板進(jìn)行間接ELISA實(shí)驗(yàn)，經(jīng)條件優(yōu)化，確立了最佳反應(yīng)條件，最佳抗原包被濃度為2.62μg/mL;最佳血清稀釋度為1∶100;最佳包被時(shí)間為4℃過夜;最佳封閉條件為1％ BSA37℃封閉1h;酶標(biāo)二抗最佳稀釋度為1∶5000，最佳底物反應(yīng)時(shí)間為4min。并對優(yōu)化后的間接ELISA方

5、法的敏感性、特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性進(jìn)行了測試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明建立的間接ELISA方法與CSFV、PRV、FMDV、PRRSV、PPV、SS2、PCV2、MHP、HPS和PCP的陽性血清均無交叉反應(yīng);批間和批內(nèi)變異系數(shù)分別為2.91％～7.61％和1.50％～3.98％;與間接免疫熒光相比較符合率為94.1％;已包被蛋白的酶標(biāo)板在-20℃中可以保存11個(gè)月以上。結(jié)果表明，本次實(shí)驗(yàn)建立的間接ELISA方法具有良好的特異性和敏感性，為商品化的P

6、1因子血清抗體檢測試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。
　　 3.江蘇及周邊四省市類豬圓環(huán)病毒因子P1流行病學(xué)調(diào)查通過建立的間接ELISA方法檢測江蘇、安徽、山東、浙江和上海五省市送檢的于2008年～2011年之間采集的1135份豬血清。江蘇檢測的兩個(gè)豬場（南京、淮安）共有血清156份，總陽性率為34.6％;安徽送檢的三個(gè)豬場（淮南、合肥、滁州）共有血清212份，總陽性率為18.9％;山東送檢的兩個(gè)豬場（青島、臨沂）共有血清148份總陽性率