白細(xì)胞介素-2對離子型谷氨酸受體功能以及培養(yǎng)海馬神經(jīng)元樹突發(fā)育、突觸發(fā)生的影響.pdf

1、白細(xì)胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)是目前研究比較廣泛的細(xì)胞因子之一，IL-2不僅具有與T細(xì)胞相關(guān)的多種免疫調(diào)節(jié)功能，同時(shí)也是一種具有多種生物學(xué)特性的細(xì)胞因子。除了IL-2的免疫活性之外，神經(jīng)生物學(xué)和神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)的研究數(shù)據(jù)表明IL-2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous systems，CNS)中發(fā)揮重要的作用。除了外周IL-2和它的特異性受體IL2受體(IL-2R)外，IL-2/IL-2R蛋白分子還廣泛存在

2、于額葉皮層、紋狀體、海馬、下丘腦、藍(lán)斑、小腦、垂體、胼胝體等腦區(qū)，也即在CNS中存在著IL-2作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，推測可能來源于內(nèi)源性神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的合成和分泌。腦源性的IL-2很可能在其介導(dǎo)的神經(jīng)調(diào)節(jié)功能或者CNS紊亂等方面發(fā)揮重要的作用；同時(shí)，外周的IL-2也能通過轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制穿過血腦屏障(blood-brainbarrier，BBB)進(jìn)入一些腦區(qū)發(fā)揮作用，提示該細(xì)胞因子為免疫、內(nèi)分泌和CNS之間的相互作用提供了體液調(diào)節(jié)的可能性。

3、 LTP與長時(shí)程抑制(long term depression，LTD)是突觸可塑性的兩種表現(xiàn)形式(方向相反)，二者的協(xié)調(diào)表達(dá)是學(xué)習(xí)與記憶能夠正常進(jìn)行的基礎(chǔ)。谷氨酸是海馬內(nèi)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，它通過與突觸后谷氨酸受體結(jié)合，激活受體，引發(fā)突觸興奮傳遞。離子型谷氨酸受體作為主要的興奮性受體參與了神經(jīng)系統(tǒng)重要功能的調(diào)節(jié)作用，尤其在突觸可塑性的研究中非常關(guān)鍵。離子型谷氨酸受體包括N-甲基-D-天(門)冬氨酸(N-methyl-D-aspart

4、ate，NMDA)受體，α-氨基-3-羥-5甲基—異惡唑丙酸(a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate，AMPA)受體以及海藻酸(kinate，KA)受體，前兩者主要分布在突觸后，而KA受體在突觸前與突觸后均有分布。AMPA和NMDA受體在海馬的突觸可塑性的研究中有關(guān)鍵作用。已經(jīng)證實(shí)NMDA受體參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程，包括癲癇癥，缺血性腦損傷，可能在神經(jīng)退行性疾病包括帕金

5、森病和阿爾茨海默病中發(fā)揮作用，并且NMDA受體掌控著海馬IXP和LTD的發(fā)生，因此提示我們NMDA受體可能會介入IL-2對突觸可塑性的調(diào)節(jié)作用。有研究發(fā)現(xiàn)IL-2能雙向調(diào)節(jié)中腦神經(jīng)元NMDA受體介導(dǎo)的電流，證實(shí)IL-2與中腦神經(jīng)元NMDA受體之間有著密切的聯(lián)系。此外，另一種離子型谷氨酸受體——AMPA受體則被認(rèn)為是突觸可塑性變化的重要調(diào)節(jié)蛋白，通過其反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了突觸活性的改變。 此外，研究發(fā)現(xiàn)IL-2對多種神經(jīng)元的生長及存活都有重

6、要的促進(jìn)作用。IL-2可為大鼠多個腦區(qū)包括海馬等的原代培養(yǎng)神經(jīng)元提供營養(yǎng)支持，能促進(jìn)神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)育，如神經(jīng)突的生長等。IL-2在空間學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的腦神經(jīng)元發(fā)育和調(diào)節(jié)中起到重要的作用。神經(jīng)元樹突是神經(jīng)元之間信息交換的場所，其長度、直徑和分支等各項(xiàng)指標(biāo)均可反映細(xì)胞的功能狀態(tài)。這些提示我們IL-2對海馬神經(jīng)元樹突發(fā)育和突觸形成可能存在著一定的影響。 本文主要通過分子構(gòu)建、原代神經(jīng)元培養(yǎng)、電生理技術(shù)、活細(xì)胞熒光成像及其它相關(guān)技術(shù)，研

7、究IL-2對離子型谷氨酸受體功能以及培養(yǎng)海馬神經(jīng)元樹突發(fā)育、突觸發(fā)生的影響，闡明IL-2的調(diào)節(jié)作用及其可能機(jī)制。 第一部分：白細(xì)胞介素-2對NMDA受體功能的影響 目的：研究IL-2對培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元和表達(dá)重組NMDA受體的HEK(humanembryonic kidney)293細(xì)胞中NMDA受體功能的影響以及初步作用機(jī)制。方法：本實(shí)驗(yàn)利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)在體外培養(yǎng)第12天(days in vitro，DIV12)到

8、DIV14的原代海馬神經(jīng)元以及表達(dá)重組NMDA受體的HEK293細(xì)胞中通過Y管系統(tǒng)給予NMDA受體激動劑記錄NMDA受體介導(dǎo)的全細(xì)胞電流(INMDA)，并用Y管系統(tǒng)給予不同濃度的IL-2處理；同時(shí)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測了HEK293細(xì)胞中IL-2Rβ亞基的表達(dá)情況。結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)1)在DIV12的神經(jīng)元中，IL-2與NMD

9、A受體激動劑同時(shí)作用時(shí)，0.01-1ng/ml IL-2能劑量依賴性快速地抑制INMDA峰值，0.1 ng/mlIL-2引起的抑制程度為47±3％(P<0.001)，而單獨(dú)Y管給IL-2不能引起細(xì)胞的任何反應(yīng)。2)IL-2對INMDA的抑制作用是一種競爭性的抑制作用，NMDA濃度越高，IL-2對INMDA的抑制程度就越低；IL-2的存在顯著增加了NMDA的EC50值，從42±7μM增加到79±4μM。3)IL-2不改變NMDA受體的反轉(zhuǎn)

10、電位和電流一電壓(I-V)曲線。4)RT-PCR結(jié)果顯示HEK293細(xì)胞中無功能性的IL-2R的存在；在分別表達(dá)重組的NMDA受體亞型NRl/NR2A和NRl/NR2B的HEK293細(xì)胞中，IL-2也能顯著地抑制含有NR2A亞基和NR2B亞基的NMDA受體的電流(INR2A and INR2B)峰值，并且抑制效率有亞型差異性，分別為54±5％(P<0.001)和30±4％ (P<0.001)。5)在培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中，用10 μM ife

11、nprodil阻斷NR2B亞型成分電流INR2B，也能觀察到IL-2對INR2A的抑制作用，與HEK293細(xì)胞中的結(jié)果相似。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了生理濃度下的IL-2(0.01-1 ng/ml)對培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的NMDA受體有顯著的抑制作用，并且這個抑制作用是IL-2濃度依賴的。在表達(dá)不同NMDA受體亞基的HEK293細(xì)胞中記錄兩種不同亞型的NMDA受體電流INR2A和INR2B，IL-2對兩者都有抑制作用，并且對INR2A的抑制程度大

12、于INR2B：IL-2對INR2A峰值的抑制作用在培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中也類似。這些結(jié)果提示著IL-2可能是直接作用于NMDA受體，而不是IL-2R依賴性的，并且這種抑制作用很可能有NMDA受體亞型的差異性。 第二部分：白細(xì)胞介素-2對培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的AMPA受體功能的影響 目的：研究IL-2對培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元AMPA受體功能的影響。方法：仍通過Y管系統(tǒng)給予AMPA受體激動劑以及不同濃度的IL-2，用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)在

13、培養(yǎng)DIV12到DIV14的大鼠海馬神經(jīng)元中記錄AMPA受體介導(dǎo)的全細(xì)胞電流(IAMPA)和AMPA受體介導(dǎo)的微小興奮性突觸后電流(AMPA-mEPSCs)。結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)1)IL-2與AMPA受體激動劑同時(shí)作用時(shí)，0.01-1 ng/ml IL-2能劑量依賴性快速地抑制IAMPA峰值，0.1ng/ml IL-2引起的抑制程度為55±6％(P<0.001)，而單獨(dú)Y管給IL-2也不能引起細(xì)胞的任何反應(yīng)。2)IL-2對IAMPA的抑制作用

14、是一種競爭性的抑制作用，谷氨酸濃度越高，IL-2對IAMPA的抑制程度就越?。籌L-2增加了谷氨酸的ECso值，從56±8μM增加到144±7μM。 3)IL-2顯著抑制AMPA-mEPSCs的幅度，抑制程度為24±6％(P<0.05)，而對頻率和衰減時(shí)間沒有影響。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了生理濃度下的IL-2(0.01-1ng/ml)對培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的AMPA受體也有顯著的抑制作用，與對NMDA受體的作用類似，但對IAMPA峰值的抑制程度

15、更為顯著：同時(shí)IL-2對AMPA-mEPSCs的抑制作用表明IL-2能抑制AMPA受體介導(dǎo)的興奮性突觸的活性，提示AMPA受體可能也介入了IL-2對突觸可塑性的調(diào)節(jié)。 第三部分：白細(xì)胞介素-2對培養(yǎng)海馬神經(jīng)元樹突發(fā)育和突觸發(fā)生的影響 目的：觀察IL-2對培養(yǎng)海馬神經(jīng)元樹突發(fā)育和突觸發(fā)生的影響。方法：本實(shí)驗(yàn)在DIV5的原代海馬神經(jīng)元中轉(zhuǎn)染能定位在膜上的綠熒光蛋白(Green fluorescentprotein，GFP)F

16、-GFP，用活細(xì)胞成像法于第7天觀察樹突絲的密度、長度和運(yùn)動情況；于第7、10、14天分別觀察樹突分支的生長情況；第14天觀察樹突棘的密度，研究不同作用濃度和時(shí)間的IL-2對以上這些形態(tài)學(xué)特征的影響。用單因素方差分析和雙尾t檢驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果作顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)1)IL-2處理后能明顯促進(jìn)培養(yǎng)第7、10、14天神經(jīng)元樹突樹的分支發(fā)育和長度，增強(qiáng)效應(yīng)與IL-2作用濃度和時(shí)間正相關(guān)。這個增強(qiáng)作用也與作用時(shí)間正相關(guān)。無論是樹突樹的分支數(shù)還

17、是長度，IL-2對DIV7神經(jīng)元的作用最顯著。2)10 ng/ml IL-2處理48小時(shí)后顯著增加了DIV7神經(jīng)元樹突絲的運(yùn)動性，以運(yùn)動的樹突絲的密度(個/100 1μm)以及運(yùn)動的樹突絲比上樹突絲總個數(shù)的百分比來表示，分別增加了30.93±12.83％(P<0.001)和44.18±7.81％(P<0.001)。3)在DIV5到DIV7、DIV5到DIV14以及DIV12到DIV14這三個時(shí)間段分別用10 ng/ml IL-2處理神經(jīng)