酸敏感離子通道的裝配及其在海馬神經(jīng)元樹突發(fā)育中的作用.pdf

1、酸敏感離子通道(ASlCs)是一類胞外質(zhì)子激活的陽(yáng)離子通道，在神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛并具有多種生理病理功能，如參與觸覺(jué)、味覺(jué)、視覺(jué)、痛覺(jué)、突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶、腦缺血和癲癇等等。ASICs屬于ENaC／DEG家族，與該家族的其他成員一樣，它有兩個(gè)疏水跨膜區(qū)，一個(gè)具有很多保守的半胱氨酸的大胞外區(qū)，氨基端和羧基端朝向胞內(nèi)側(cè)?，F(xiàn)已克隆得到四個(gè)基因編碼的6個(gè)ASIC亞單位，分別是ASICla及其剪接變體ASIClb，ASIC2a及其剪接變體ASIC

2、2b，ASIC3和ASIC4。中樞神經(jīng)元中主要表達(dá)ASICIa， 2a，2b，其中ASICla是主要的功能性亞基，ASICla同聚體通道介導(dǎo)一種快速，瞬時(shí)的內(nèi)向電流，通透鈉離子和鈣離子，半最大激活pH值(pH0.5)為～6.2。ASIC2a同聚體通道對(duì)質(zhì)子的敏感性很低，pH0.5為～4.4。ASIC2b不能形成功能性同聚體通道，但是可以和其它亞單位裝配在一起，形成具有不同性質(zhì)的異聚體通道。功能性的ASICs通常被認(rèn)為是由相同或不同的亞單

3、位形成的四聚體，然而最近Gouaux等的晶體結(jié)構(gòu)研究表明ASICl同聚體由三個(gè)亞單位裝配而成。 近來(lái)研究表明ASICs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起很重要的作用，參與突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶和軸突退化等。2002年Welsh實(shí)驗(yàn)室利用ASIC1敲除小鼠發(fā)現(xiàn)ASIC1的缺失可以損傷海馬依賴的LTP，損傷空間記憶和眨眼反射;隨后該小組又發(fā)現(xiàn)ASIC1敲除小鼠對(duì)線索和背景條件性恐懼反應(yīng)有所降低，然而在杏仁核和其他腦區(qū)過(guò)表達(dá)ASIC1，則可以增強(qiáng)背景條

4、件性恐懼。最近海馬腦片上的一項(xiàng)研究表明定位在樹突棘上ASIC1a亞基可以影響樹突棘的密度，抑制ASICla的表達(dá)降低樹突棘的數(shù)目，而過(guò)表達(dá)ASICla則有相反的作用，其機(jī)制是通過(guò)影響胞內(nèi)Ca2+濃度和CaMKII磷酸化。Friesc等(2007)發(fā)現(xiàn)與野生型相比，在ASIC1敲除小鼠中，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)所產(chǎn)生的臨床缺陷和軸突退化明顯減輕，表明ASIC1參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫炎癥中的軸突退化。在本論文中，我們研究了活細(xì)

5、胞中酸敏感離子通道的裝配，并且初步探討了酸敏感離子通道在海馬神經(jīng)元樹突發(fā)育中的作用。 1.用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)方法研究酸敏感離子通道的裝配 用經(jīng)典的方法如免疫共沉淀或電生理分析，認(rèn)為大多數(shù)亞單位可以形成同聚體或異聚體復(fù)合物，然而關(guān)于活細(xì)胞中ASICs亞單位裝配以及ASICs異聚體中各亞單位分子比的情況并不清楚。在本研究中，我們采用了一種生物物理的方法——熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorcscence Resonan

6、ce Energy Transfer，F(xiàn)RET)，在活細(xì)胞中直接研究ASICs的裝配情況。因?yàn)镕RET技術(shù)具有非侵襲性，可以在活細(xì)胞中分析蛋白一蛋白之間的相互作用，還具有高空間分辨率，被稱為“分子尺"，已經(jīng)被成功應(yīng)用于多種受體和通道的分子比、裝配等研究中。我們將各種ASICs亞單位的羧基端標(biāo)記上CFP和YFP，然后將這些構(gòu)建物轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中，通過(guò)三通道FRET成像，先計(jì)算FR值，再根據(jù)建立的四聚體或三聚體FRET模型推測(cè)出相鄰亞單位

7、之間的FRET效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不管用四聚體FRET模型，還是用三聚體FRET模型，標(biāo)記了CFP和YFP的同一種亞單位共表達(dá)時(shí)都可以檢測(cè)到顯著的FRET信號(hào)，表明ASIC亞單位可裝配成同聚體通道；標(biāo)記了CFP和YFP的不同亞單位共表達(dá)在CHO細(xì)胞中時(shí)，也可以檢測(cè)到顯著的FRET信號(hào)，表明ASIC亞單位可以裝配成異聚體通道。另外，我們還對(duì)ASIC異聚體的分子比情況進(jìn)行了初步的探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)如果所形成的ASICs異聚體通道是四聚體，那么每

8、種亞單位有兩個(gè)，分子比傾向于2：2；如果是三聚體，則提示ASICs的裝配是隨意的，分子比是不固定的，2：1和1：2這兩種情況都存在。這項(xiàng)研究為ASIC同聚體和異聚體裝配提供了一些新的證據(jù)，這種亞單位組成的差異形成了ASICs的功能異質(zhì)性，并很大程度上成為ASICs多樣而復(fù)雜的生理功能的內(nèi)在結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 2.酸敏感離子通道在海馬神經(jīng)元樹突發(fā)育中的作用 樹突的生長(zhǎng)和分支對(duì)功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成非常重要，然而有關(guān)ASICs在樹突

9、發(fā)育中的作用則鮮有報(bào)道。在本研究中，我們?cè)隗w外培養(yǎng)第五天(days in vitro，DIV5)的原代海馬神經(jīng)元中轉(zhuǎn)染定位在膜上的GFP(F-GFP)，隨后加入ASICs拮抗劑抑制ASICs的功能，觀察DIV8和DIV14這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)元的樹突生長(zhǎng)、分支復(fù)雜程度，來(lái)研究酸敏感離子通道是否會(huì)影響海馬神經(jīng)元的樹突發(fā)育。結(jié)果發(fā)現(xiàn)短時(shí)間抑制ASICs的功能并不影響海馬神經(jīng)元的樹突總長(zhǎng)度和分支，而長(zhǎng)時(shí)間抑制ASICs的功能則會(huì)降低樹突總長(zhǎng)度