NF-κB介導(dǎo)大鼠背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)機(jī)械刺激后熱痛覺過敏及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　 背根神經(jīng)節(jié)(dorsalrootganglion，DRG)的持續(xù)受壓(chroniccompressionofDRG,CCD)和椎管狹窄或椎間盤突出壓迫神經(jīng)根是臨床上根性神經(jīng)疼痛的主要原因之一。CCD大鼠模型是一種典型的神經(jīng)疼痛模型，它可以產(chǎn)生自發(fā)性疼痛、機(jī)械性的熱痛覺過敏和異常疼痛，伴隨著受壓迫神經(jīng)元的自發(fā)性放電增加，電流閾值和動作電位降低。外周神經(jīng)損傷能夠通過背根神經(jīng)節(jié)和脊髓中一系列復(fù)雜的分子級聯(lián)反應(yīng)誘發(fā)神經(jīng)病

2、理性疼痛，包括腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor，TNF-α)、白介素-6（interleukin-6，IL-6）和核因子κB(nuclearfactor-kappaB，NF-κB)。細(xì)胞內(nèi)的第二信使環(huán)磷腺苷(cyclicadenosinemonophosphate，cAMP)-依賴性的蛋白激酶A(proteinkinaseA，PKA)和環(huán)磷鳥苷(cyclicguanosinemonophosphate，cGMP)-依

3、賴性的蛋白激酶G(proteinkinaseG，PKG)介導(dǎo)CCD大鼠的痛覺過敏和受壓神經(jīng)元的高興奮性。另外，多種離子通道被認(rèn)為參與并傳遞持續(xù)受壓后DRG神經(jīng)元的傷害性刺激，如電壓門控性Na+通道和K+通道、超極化激活性陽離子通道和瞬時感受器電位離子通道香草素受體亞家族4通道(transientreceptorpotentialvanilloid，TRPV4)等。TRPV4是一種多覺型感受器，可被低滲、機(jī)械刺激、熱、佛波醇酯、低pH值、

4、檸檬酸鹽、anandamide(AEA)和其代謝產(chǎn)物花生四烯酸(arachidonicacid,AA)、以及bisandrographolideA(BAA)等激活。前列腺素E2(PGE2)可增強(qiáng)低滲(17mOsm)或中度高滲溶液刺激(2％NaCl，607mOsm)引起的機(jī)械性痛覺過敏和異常疼痛，TRPV4通道參與介導(dǎo)上述炎癥性痛覺反應(yīng)。TRPV4基因敲除的小鼠表現(xiàn)出體液滲透壓調(diào)節(jié)功能異常，對傷害性壓力刺激的回避反應(yīng)降低，但對非傷害性熱和

5、觸覺刺激的反應(yīng)正常。TRPV4基因敲除小鼠也表現(xiàn)出對炎癥引起的熱痛覺過敏降低。一氧化氮(nitricoxide，NO)是動物疼痛模型中一種重要的參與傷害活動的調(diào)質(zhì)，并且介導(dǎo)了神經(jīng)病理疼痛的發(fā)生。有文獻(xiàn)報道，TRPV4的激動劑4α-PDD(4α-phorbol12，13-didecanoate)和低滲溶液的刺激在毛豚鼠耳蝸的細(xì)胞外層能夠誘導(dǎo)一氧化氮的合成，而通過TRPV4的阻斷劑釕紅(rutheniumred,RR)能夠抑制一氧化氮的生成

6、。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，TRPV4-NO-cGMP-PKG信號通路在CCD大鼠熱痛覺過敏中發(fā)揮重要的作用。然而，到目前為止，在CCD大鼠熱痛覺過敏中TRPV4與NO之間的具體的機(jī)制尚不清楚。
　　 NF-κB是基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子，由Rel家族的多亞基蛋白組成，包括:p50，p52，p65(RelA)，c-RelandRelB。NF-κB在細(xì)胞的生長、分化、壞死和凋亡過程中起重要作用，廣泛參與腫瘤、炎癥等病理過程。在正常狀態(tài)下或者在

7、靜息狀態(tài)的細(xì)胞中，NF-κB與其抑制性蛋白I-κB結(jié)合，以二聚體的形式存在于細(xì)胞漿中，最常見的是二聚體是p65/p50。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時，I-κB蛋白被迅速磷酸化并與NF-κB解離，游離的NF-κB轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，參與眾多基因的誘導(dǎo)表達(dá)。當(dāng)受到細(xì)胞因子、氧化應(yīng)急、一些化學(xué)和疼痛性傷害時，NF-κB被激活。最近，有研究者發(fā)現(xiàn)，在脊髓和背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中NF-κB參與傷害性感覺信息的傳遞。低頻和高頻的電針灸刺激能夠降低NF-κB敲出小鼠

8、的痛覺敏感性。Bunnell等發(fā)現(xiàn)NF-κB的激活發(fā)生在背根神經(jīng)節(jié)和脊髓，參與傷害性信息的傳遞和處理，部分坐骨神經(jīng)損傷后大鼠腰背根神經(jīng)節(jié)NF-κB的活性增加。Chan等對大鼠的后爪皮下注射弗羅因德佐劑做痛覺過敏模型，觀察大鼠腰脊髓NF-κB表達(dá)的時程差異性，證實NF-κB在弗羅因德佐劑產(chǎn)生的痛敏實驗的炎癥前狀態(tài)發(fā)揮重要作用。這些證據(jù)NF-κB參與介導(dǎo)了神經(jīng)病理疼痛的傳遞。因此，我們推測在CCD大鼠熱痛覺過敏中NF-κB可能參與了TRPV

9、4-NO的信號通路。
　　 目的：
　　 研究NF-κB介導(dǎo)的TRPV4-NO信號通路在CCD大鼠熱痛覺過敏中的作用。
　　 方法：
　　 1.建立CCD模型
　　 將大鼠隨機(jī)分為CCD組和假手術(shù)組。大鼠先用戊巴比妥鈉（50mg/kg，腹腔注射）麻醉后，沿L4-S1棘突作后正中偏右切口，暴露右側(cè)L4及L5椎間外孔，將“L”形棒的一端沿L4及L5椎間外孔的前壁上方水平插入椎管內(nèi)，另一端位于椎管壁外。

10、通過控制“L”形棒椎管壁外側(cè)端使其椎管內(nèi)端沿椎骨內(nèi)壁緩慢下滑至椎管中部，使之?dāng)D壓L4、L5的大鼠背根神經(jīng)節(jié)。術(shù)后用生理鹽水沖洗切口，依層縫合肌肉、腰背筋膜和皮膚，腹腔注射青霉素預(yù)防感染。假手術(shù)組除不插鋼棒壓迫神經(jīng)節(jié)外，其余操作同手術(shù)組。術(shù)后大鼠沒有發(fā)生自殘現(xiàn)象，也沒有表現(xiàn)出感覺完全缺失。
　　 2.NF-κB的阻斷劑對熱痛敏感性的影響
　　 為了測量NF-κB的阻斷劑對熱痛敏感性的影響，大鼠被隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham組

11、）、NF-κB的阻斷劑（PDTC或BAY）處理組、生理鹽水處理組。其中通過NF-κB的阻斷劑PDTC處理組又分成PDTC(10-1M)組、PDTC（10-2M）組、PDTC(10-3M)三個亞組;NF-κB的阻斷劑的另外一種阻斷劑BAY處理組又分成BAY(100μM)組、BAY(50μM)組、BAY(25μM)三個亞組。假手術(shù)組中未接受任何處理的大鼠作為對照，CCD組中只接受CCD手術(shù)的大鼠作為對照。NF-κB的阻斷劑(PDTC或BAY

12、)溶于0.9％的生理鹽水通過鞘內(nèi)注射，40μg/d，每天一次，共7天。
　　 3.神經(jīng)行為學(xué)測定
　　 于手術(shù)前連續(xù)測兩天，每天一次。術(shù)后7天藥物處理前2小時再次測量，排除痛覺表現(xiàn)不明顯者(＜5％)，藥物處理后1、2、4、8、24小時分別測量。對于鞘內(nèi)注射NF-κB的阻斷劑（PDTC或BAY）的大鼠，痛覺測量則在最后一次注射后12小時進(jìn)行。
　　 熱輻射刺激縮爪反應(yīng)潛伏期(thermalwithdrawllate

13、ncy)使用BME-410A型熱痛刺激儀，將熱痛刺激儀放在6mm厚的有機(jī)玻璃板下方，使光源焦距照射動物后肢足底掌心，電子秒表記錄從照射開始到引起后肢回縮反應(yīng)時的潛伏期作為熱痛覺觀測指標(biāo)。取每只大鼠5次測量結(jié)果的均值為統(tǒng)計數(shù)據(jù)。
　　 結(jié)果
　　 1.NF-κB的阻斷劑PDTC對大鼠熱痛覺過敏的影響
　　 與假手術(shù)組相比，CCD大鼠產(chǎn)生明顯的熱痛覺過敏(n=8，F(xiàn)=245.054，P＜0.001)。鞘內(nèi)注射不同濃度

14、的NF-κB的阻斷劑PDTC（10-1M、10-2M、10-3M）各40μl，分別測注射后0、1、2、4、8和24h時的熱刺激縮爪時間，結(jié)果顯示:與生理鹽水組相比，濃度10-1M、10-2M的PDTC對CCD后大鼠的熱痛覺過敏產(chǎn)生抑制作用(n=8，P＜0.001)，此抑制作用注射后1h可測得，4h作用達(dá)到最大，大約能夠持續(xù)到8h，直到24h作用消失。而濃度10-3M的PDTC對CCD后大鼠的熱痛覺過敏沒有明顯的抑制作用(n=8，P＞0.

15、05)。
　　 2.NF-κB的阻斷劑BAY對大鼠熱痛覺過敏的影響
　　 與假手術(shù)組相比，CCD大鼠產(chǎn)生明顯的熱痛覺過敏(n=8，F(xiàn)=253.816，P＜0.001)。鞘內(nèi)注射不同濃度的NF-κB的阻斷劑BAY(100uM、50uM、25uM)各40μl，分別測注射后0、1、2、4、8和24h時的熱刺激縮爪時間，結(jié)果顯示:與生理鹽水組相比，濃度100uM、50uM的PDTC對CCD后大鼠熱痛覺過敏產(chǎn)生抑制作用(n=8，P

16、＜0.001)，此抑制作用注射后1h可測得，4h作用達(dá)到最大，大約能夠持續(xù)到8h，直到24h作用消失。而濃度25uM的PDTC對CCD后大鼠的熱痛覺過敏沒有明顯的抑制作用(n=8，P＞0.05)。
　　 3.TRPV4激動劑4α-PDD對NF-κB的阻斷劑PDTC的作用
　　 鞘內(nèi)注射NF-κB的阻斷劑PDTC(10-1M)，分別測注射后0、1、2、4、8和24h時的熱刺激縮爪時間。與生理鹽水組相比，PDTC(10-1M

17、)對CCD后大鼠熱痛覺過敏產(chǎn)生抑制作用(n=8，P＜0.001)。鞘內(nèi)注射TRPV4激動劑4α-PDD(1nmol)預(yù)處理后，能夠明顯逆轉(zhuǎn)PDTC(10-1M)對CCD后大鼠熱痛覺過敏產(chǎn)生抑制作用(n=8，P＜0.001)。
　　 4.TRPV4激動劑4α-PDD對NF-κB的阻斷劑BAY的作用
　　 鞘內(nèi)注射NF-κB的阻斷劑BAY(100uM)，分別測注射后0、1、2、4、8和24h時的熱刺激縮爪時間。與生理鹽水組相