Cryoloop玻璃化冷凍對小鼠4細(xì)胞期、8細(xì)胞期及囊胚期胚胎發(fā)育潛能的影響.pdf

1、1978年，世界第一例試管嬰兒Louis Brown誕生的消息傳來，世界各國的人們集聚無比興奮的心情與追逐先進(jìn)的欲望，紛紛開始開展這項技術(shù)。隨著輔助生育技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)的發(fā)展，胚胎冷凍技術(shù)已經(jīng)成為其發(fā)展不可分割的一部分。玻璃化冷凍是一種比較新的冷凍保存方法，是在高濃度的冷凍保護(hù)劑的存在下，使細(xì)胞快速冷凍，形成玻璃態(tài)，避免了細(xì)胞內(nèi)外冰晶形成對細(xì)胞的破壞作用。由于其大大簡化了冷

2、凍程序，縮短了冷凍時間，不需要昂貴的冷凍設(shè)備，提高了冷凍效果，具有廣闊的應(yīng)用前景。影響玻璃化冷凍的因素很多，首先冷凍保護(hù)劑的毒性是玻璃化冷凍的最大障礙，為了降低其毒性作用，人們不斷改進(jìn)冷凍技術(shù)和冷凍載體，提高冷凍速率。其次胚胎本身的原因也逐漸被人們所重視，理論上講，玻璃化冷凍可以用于種植前胚胎的任何階段，但由于胚胎從1細(xì)胞到囊胚，細(xì)胞體表面積、細(xì)胞膜成分及通透性不斷發(fā)生改變，冷凍效果有明顯差異。雖目前卵裂期及囊胚期的玻璃化冷凍技術(shù)已在眾

3、多中心應(yīng)用，但仍處于應(yīng)用的初期階段，各家報道的胚胎復(fù)蘇率差異很大。提高玻璃化冷凍后胚胎復(fù)蘇率的穩(wěn)定性，建立公認(rèn)的玻璃化冷凍方案，并研究玻璃化冷凍對各個發(fā)育階段胚胎的影響，是當(dāng)前玻璃化冷凍急需了解的問題。本研究以Cryoloop為載體對不同發(fā)育階段小鼠胚胎冷凍，期望此方法在胚胎冷凍的臨床應(yīng)用提供參考價值。
　　 目的:實驗以小鼠4細(xì)胞期、8細(xì)胞期及囊胚期胚胎作為實驗對象，對卵裂期胚胎及囊胚期進(jìn)行玻璃化冷凍研究，探討卵裂期及囊胚期胚

4、胎玻璃化冷凍在臨床的應(yīng)用。
　　 方法:
　　 1、取材:昆明小鼠以PMSG常規(guī)促排卵，體外受精，分別于HCG后48～50小時、60～62小時和85～96小時取4細(xì)胞期、8細(xì)胞期和囊胚期胚胎分三組進(jìn)行玻璃化冷凍。以相應(yīng)發(fā)育階段未經(jīng)冷凍胚胎為對照組。
　　 2、玻璃化冷凍與復(fù)蘇:胚胎首先用預(yù)平衡液7.5％(v/v) EG、7.5％(v/v)DMSO平衡2分鐘;然后轉(zhuǎn)入15％(v/v) EG、15％(v/v) DMS

5、O、0.65M sucrose的玻璃化冷凍液中，時間控制在25-30秒。胚胎復(fù)蘇采用0.33M、0.2M、0M sucrose復(fù)蘇液，梯度稀釋逐步洗脫冷凍保護(hù)劑，平衡時間分別為2min、3min和5min。
　　 3、結(jié)果判斷:凍融后，在倒置顯微鏡下觀察根據(jù)胚胎解凍后的形態(tài)完整性來判斷胚胎存活情況，用存活率表示;其次是在體外的繼續(xù)發(fā)育能力，用囊胚形成率和孵出率表示。
　　 結(jié)果:凍融后的4細(xì)胞期、8細(xì)胞期及囊胚期胚胎的形

6、態(tài)學(xué)無異常;共冷凍了胚胎291枚，存活272枚，存活率為93.5％(272/291);三組胚胎凍融后的存活率之間沒有差異(P＞0.05)。凍融后的三組胚胎繼續(xù)培養(yǎng)，4細(xì)胞期和8細(xì)胞期囊胚形成率及囊胚孵出率均低于相應(yīng)囊胚期和對照組（P＜0.05）。囊胚期冷凍組囊胚孵出率與對照組相似。
　　 結(jié)論:Cryoloop法玻璃化冷凍三組胚胎，凍融后的胚胎存活率三組之間無差異，凍融后4細(xì)胞組與8細(xì)胞組的胚胎相比，囊胚形成率沒有下降，但囊胚孵