內(nèi)毒素對人外周血單個核細胞向血管內(nèi)皮細胞分化的影響.pdf

1、近年來，在糖尿病足的治療方面有了很多的進展，但仍有一部分患者因為病程較長血管損傷嚴重，動脈遠端無流出道，使得臨床治療非常棘手，難以取得令人滿意的療效，最終導致截肢甚至危及患者的生命。因此，臨床上迫切需要尋找一種創(chuàng)傷小、患者容易接受且療效好的新的治療方法。干細胞移植技術(shù)的出現(xiàn)為糖尿病足的治療帶來了新的前景，近年來已成為國內(nèi)外學者研究的熱點之一。然而，臨床上干細胞移植治療糖尿病足受患者機體代謝狀態(tài)、血糖水平、氧化應激及內(nèi)毒素等微環(huán)境因素影響

2、，臨床療效也相應發(fā)生改變。因此，本研究通過觀察脂多糖（LPS）對外周血單個細胞(PBMCs)向血管內(nèi)皮細胞(VECs)分化過程的影響，為臨床干細胞治療糖尿病足的最佳時機奠定理論基礎(chǔ)。
　　目的：觀察不同濃度LPS對外周血單個核細胞體外向血管內(nèi)皮細胞分化能力的影響。
　　方法：無菌條件下取健康成人外周血20ml,肝素抗凝，應用密度梯度離心法分離成人外周血單核細胞，向DMEM-F12培養(yǎng)基中分別加入體積分數(shù)20％的胎牛血清、血管

3、內(nèi)皮生長因子（VEGF）和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF），對PBMNCs進行誘導培養(yǎng)48h后，收集貼壁細胞培養(yǎng)后加入不同濃度 LPS（0.00μ g/mL、0.01μ g/mL、0.10μ g/mL、1.00μ g/mL、10.00μ g/mL）并干預72h，運用流式細胞儀檢測內(nèi)皮祖細胞表面標志Flk-1，并計算陽性細胞百分數(shù)；20天后運用流式細胞術(shù)檢測誘導后的細胞表達CD31和vWF情況。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)改變。

4、　　結(jié)果：
　　①誘導分化后細胞形態(tài)學改變：倒置相差顯微鏡下，實驗組1（LPS0.00μ g/mL）中細胞在培養(yǎng)基內(nèi)呈貼壁生長，經(jīng)VEGF和bFGF誘導后，原代細胞多呈圓形和梭形，接著形成細胞集落，隨后可見部分細胞融合，細胞呈鋪路石樣排列生長。實驗組2-5：（LPS0.01-10μg/mL）倒置相差顯微鏡下，PBMCs誘導分化過程中細胞形態(tài)與實驗組1基本相同，均經(jīng)歷了小圓形→梭形→扁平細胞的演變過程。但實驗組2（0.01μg/mL

5、 LPS）貼壁的細胞更多，最后形成的梭形細胞數(shù)量也最多；實驗組3至實驗組5，隨著LPS濃度的增加，貼壁細胞及梭形細胞數(shù)量呈現(xiàn)遞減趨勢。
　　②流式細胞檢測結(jié)果顯示，體外經(jīng)VEGF和bFGF誘導分化后，與對照組相比，實驗組1 FLK-1陽性細胞、CD31/vWF雙陽性細胞數(shù)量明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義，與實驗組1相比較，0.01μg/mL LPS干預組 FLK-1陽性細胞、CD31/vWF雙陽性細胞升高明顯，差異有統(tǒng)計學意義，而0.

6、10μg/mL LPS對FLK-1陽性細胞、CD31/vWF雙陽性細胞呈下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，1.00μg/mL和10.00μg/mL LPS干預組FLK-1陽性細胞、CD31/vWF雙陽性細胞明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：可通過密度梯度離心法和貼壁黏附培養(yǎng)法相結(jié)合從外周血中分離、純化獲取外周血單個核細胞。體外培養(yǎng)的外周血單個核細胞通過血管內(nèi)皮生長因子和堿性成纖維生長因子的誘導，成功分化為血管內(nèi)皮細胞，提示外周血