流體應(yīng)力對兔骨髓MSCs向血管內(nèi)皮細胞表型分化的影響.pdf

1、骨移植材料植入體內(nèi)后，必須盡快建立充分的血供，為骨組織修復(fù)或改建提供充足的營養(yǎng)，這在完成較大骨缺損修復(fù)時，尤為重要。血管生成是一個集細胞、細胞因子、細胞外基質(zhì)、生物力學(xué)刺激等多種因素的復(fù)雜過程。既往的研究多側(cè)重于應(yīng)用VEGF，bFGF等促血管生成因子，但存在劑量不易調(diào)控，甚至導(dǎo)致血管瘤發(fā)生等缺陷。因此，探討給予外源性的血管內(nèi)皮細胞來促進局部血管生成成為新的研究策略。 獲取自體的血管內(nèi)皮細胞存在較大的創(chuàng)傷，且細胞獲取有限，而近年來

2、研究發(fā)現(xiàn)具有多向分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)外相應(yīng)的誘導(dǎo)條件下，有進一步分化為內(nèi)皮細胞表型，進而參與局部的血管生成可能。為此，本課題初步探討流體應(yīng)力對體外培養(yǎng)的兔骨髓間充質(zhì)細胞向血管內(nèi)皮細胞表型分化的影響。從而篩選出適宜的力學(xué)條件，為利用自體骨髓MSCs促血管生成奠定理論基礎(chǔ)。 一、目的: 模擬體內(nèi)血流動力狀態(tài)，建立正壓條件下流體應(yīng)力裝置，并用此裝置單獨或聯(lián)合血管內(nèi)皮細胞生長因子來刺激兔BM-MSCs向血管內(nèi)皮細胞表

3、型的分化，為進一步應(yīng)用該細胞來促血管生成的治療創(chuàng)造條件。 二、方法: 1、通過梯度離心分離兔骨髓單核細胞，再結(jié)合定期換液的體外培養(yǎng)方法，獲取兔BM-MSCs。通過測定細胞的增殖能力和成骨、成脂肪分化來鑒定細胞。 2、將目前常規(guī)使用的流體應(yīng)力裝置(平行板流動腔)中流體的負(fù)壓狀態(tài)，改良為正壓狀態(tài)，通過比較改良前后的平板流動腔內(nèi)的壓強、流量、流動的波形，分析兔骨髓MSCs增殖能力和表型變化來判斷該裝置對細胞生物學(xué)特性的

4、影響。 以不同的流體應(yīng)力作用于平行板流動腔內(nèi)的兔MSCs，分別于3、6、12和24h后通過胎盤蘭染色檢測活細胞比例，免疫組織化學(xué)染色檢測細胞CD31陽性表達率。將活細胞比例超過80％并CD31陽性率超過70％的實驗組條件，作為適宜的流體應(yīng)力刺激大小和作用時間。 3、以適宜的流體應(yīng)力作用于平行板流動腔內(nèi)的兔骨髓MSCs作為實驗組1，流體應(yīng)力聯(lián)合VEGF作用兔骨髓MSCs作為實驗組2，VEGF對常規(guī)培養(yǎng)兔骨髓MSCs的誘導(dǎo)作

5、為陽性對照組，靜置培養(yǎng)于平行板流動腔的兔骨髓MSCs作為空白對照組；24h后檢測細胞形態(tài)、表型和功能的變化。形態(tài)學(xué)指標(biāo)包括：倒置相差顯微鏡直接觀察；表型檢測指標(biāo)包括：CD31和Ⅷ因子免疫組織化學(xué)染色、透射電鏡定性觀察特異的W-P小體等超微結(jié)構(gòu)；功能檢測分析：通過細胞在膠原凝膠內(nèi)能否形成類小管樣結(jié)構(gòu)的Tube-forming實驗來判斷誘導(dǎo)細胞的部分生物學(xué)功能。 4.初步探討VEGF表達在兔骨髓MSCs向血管內(nèi)皮細胞表型分化中的作用

6、：分別收集流體應(yīng)力刺激后的MSCs、外源性VEGF刺激后的MSCs、流體應(yīng)力聯(lián)合VEGF刺激兔骨髓MSCs和常規(guī)傳代培養(yǎng)的MSCs進行RT-PCR實驗，檢測分析4組細胞中VEGFmRNA的表達差異。 三、主要結(jié)果和結(jié)論: 1、適宜的流體應(yīng)力：當(dāng)0.6dyn/cm224h兔骨髓MSCs可達到活細胞比例為86％并CD31陽性率超過84％。所以選0.6dyn/cm2作用24h為適宜的流體應(yīng)力條件。 2、改良后的細胞應(yīng)力

7、裝置：平行板流動腔內(nèi)的壓強由負(fù)壓變?yōu)檎龎海⑶译S流速的增加而增高；在流量O～0.12ml時，壓強波動不超過1.0mmHg，可近似認(rèn)為是穩(wěn)定流；在流量0.12～1.45ml時壓強波動較大，可達9mmHg，認(rèn)為是波動流。以0.6dyn/cm2作用24h的后條件下，通過MTT實驗顯示培養(yǎng)在正壓和負(fù)壓狀態(tài)下的細胞組OD值分別是0.261±0.030、0.282±0.034，P=0.291。在正壓流組、負(fù)壓流組、空白對照組中，CD31免疫組化PU

8、值為13.21士0.19、9.84±0.26、0.56±0.36，正壓流組和負(fù)壓流組相比P=O.001。因此將平行板流動腔壓強由負(fù)壓調(diào)整為正壓后對細胞增殖無明顯影響，而對BM-MSCs的內(nèi)皮細胞表型分化有促進作用，應(yīng)用該裝置和適宜的刺激條件將更有利于利用流體應(yīng)力促進MSCs誘導(dǎo)分化的研究。 3、流體應(yīng)力對兔BM-MSCs向血管內(nèi)皮細胞表型分化的影響 倒置相差顯微鏡觀察：實驗組1、實驗組2在細胞接種后呈纖維樣細胞結(jié)構(gòu)，作用

9、24h大部分細胞呈鋪路石狀，細胞數(shù)量較兩個對照組少；而陽性對照組中(VEGF誘導(dǎo)組)細胞同時存在短梭形和鋪路石樣細胞；空白對照組中細胞仍呈梭形。 透射電鏡觀察：在實驗組1、實驗組2和陽性對照組發(fā)現(xiàn)特征性W-P小體，在空白對照組中未見該結(jié)構(gòu)。 免疫組織化學(xué)染色：實驗組1、實驗組2、陽性對照組和空白對照組中，細胞CD31圖像分析4組樣本的PU值分別為11.38±0.83、12.10±0.82、11.06±0.67、1.42±

10、0.26，實驗組1、和實驗組2、陽性對照組之間相比P＞0.05，但較空白對照組P＜0.05；細胞Ⅷ因子圖像分析4組樣本的PU值分別為15.68±1.41、15.16±0.75、14.07±0.95、1.02±0.60，實驗組1、和實驗組2、陽性對照組之間相比P＞0.05，但較空白對照組P＜0.05。 Tube-forming實驗：實驗組1、實驗組2和陽性對照組細胞都能在鼠尾膠原凝膠上成小管；形成的小管樣結(jié)構(gòu)平均長度分別：實驗組1

11、為364.21±10.31mm/cm2、實驗組2為442.92±19.62mm/cm2、陽性對照組為360.06±9.78mm/cm2、空白對照組為14.35±11.59mm/cm2，實驗組1、實驗組2和陽性對照組較空白對照組P＜0.05，差異有顯著性；實驗組1較陽性對照組P＞0.05；實驗組2較實驗組1和陽性對照組P＜0.05。 因此通過透射電鏡觀察和免疫組織化學(xué)分析，表明流體應(yīng)力、VEGF和兩者聯(lián)合應(yīng)用均能促進兔BM-MSC

12、s表達CD31和Ⅷ因子，并產(chǎn)生特異性的W-P小體，從而具有血管內(nèi)皮細胞表型。通過Tube-forming實驗，提示流體應(yīng)力、VEGF和兩者聯(lián)合應(yīng)用后的誘導(dǎo)細胞，在體外具有與血管內(nèi)皮細胞類似的生物學(xué)功能；流體應(yīng)力和VEGF聯(lián)合應(yīng)用可能更有利于誘導(dǎo)細胞表達生物學(xué)功能。 4、VEGFmRNA表達：通過RT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)，實驗組1、實驗組2、陽性對照組和陰性對照組各組之間VEGFmRNA表達無顯著性差別，切應(yīng)力并未使得兔BM-MSCs