流體應力對兔骨髓MSCs向血管內皮細胞表型分化的影響.pdf

1、骨移植材料植入體內后，必須盡快建立充分的血供，為骨組織修復或改建提供充足的營養(yǎng)，這在完成較大骨缺損修復時，尤為重要。血管生成是一個集細胞、細胞因子、細胞外基質、生物力學刺激等多種因素的復雜過程。既往的研究多側重于應用VEGF，bFGF等促血管生成因子，但存在劑量不易調控，甚至導致血管瘤發(fā)生等缺陷。因此，探討給予外源性的血管內皮細胞來促進局部血管生成成為新的研究策略。 獲取自體的血管內皮細胞存在較大的創(chuàng)傷，且細胞獲取有限，而近年來

2、研究發(fā)現(xiàn)具有多向分化潛能的骨髓間充質干細胞在體內外相應的誘導條件下，有進一步分化為內皮細胞表型，進而參與局部的血管生成可能。為此，本課題初步探討流體應力對體外培養(yǎng)的兔骨髓間充質細胞向血管內皮細胞表型分化的影響。從而篩選出適宜的力學條件，為利用自體骨髓MSCs促血管生成奠定理論基礎。 一、目的: 模擬體內血流動力狀態(tài)，建立正壓條件下流體應力裝置，并用此裝置單獨或聯(lián)合血管內皮細胞生長因子來刺激兔BM-MSCs向血管內皮細胞表

3、型的分化，為進一步應用該細胞來促血管生成的治療創(chuàng)造條件。 二、方法: 1、通過梯度離心分離兔骨髓單核細胞，再結合定期換液的體外培養(yǎng)方法，獲取兔BM-MSCs。通過測定細胞的增殖能力和成骨、成脂肪分化來鑒定細胞。 2、將目前常規(guī)使用的流體應力裝置(平行板流動腔)中流體的負壓狀態(tài)，改良為正壓狀態(tài)，通過比較改良前后的平板流動腔內的壓強、流量、流動的波形，分析兔骨髓MSCs增殖能力和表型變化來判斷該裝置對細胞生物學特性的

4、影響。 以不同的流體應力作用于平行板流動腔內的兔MSCs，分別于3、6、12和24h后通過胎盤蘭染色檢測活細胞比例，免疫組織化學染色檢測細胞CD31陽性表達率。將活細胞比例超過80％并CD31陽性率超過70％的實驗組條件，作為適宜的流體應力刺激大小和作用時間。 3、以適宜的流體應力作用于平行板流動腔內的兔骨髓MSCs作為實驗組1，流體應力聯(lián)合VEGF作用兔骨髓MSCs作為實驗組2，VEGF對常規(guī)培養(yǎng)兔骨髓MSCs的誘導作

5、為陽性對照組，靜置培養(yǎng)于平行板流動腔的兔骨髓MSCs作為空白對照組；24h后檢測細胞形態(tài)、表型和功能的變化。形態(tài)學指標包括：倒置相差顯微鏡直接觀察；表型檢測指標包括：CD31和Ⅷ因子免疫組織化學染色、透射電鏡定性觀察特異的W-P小體等超微結構；功能檢測分析：通過細胞在膠原凝膠內能否形成類小管樣結構的Tube-forming實驗來判斷誘導細胞的部分生物學功能。 4.初步探討VEGF表達在兔骨髓MSCs向血管內皮細胞表型分化中的作用

6、：分別收集流體應力刺激后的MSCs、外源性VEGF刺激后的MSCs、流體應力聯(lián)合VEGF刺激兔骨髓MSCs和常規(guī)傳代培養(yǎng)的MSCs進行RT-PCR實驗，檢測分析4組細胞中VEGFmRNA的表達差異。 三、主要結果和結論: 1、適宜的流體應力：當0.6dyn/cm224h兔骨髓MSCs可達到活細胞比例為86％并CD31陽性率超過84％。所以選0.6dyn/cm2作用24h為適宜的流體應力條件。 2、改良后的細胞應力

7、裝置：平行板流動腔內的壓強由負壓變?yōu)檎龎?，并且隨流速的增加而增高；在流量O～0.12ml時，壓強波動不超過1.0mmHg，可近似認為是穩(wěn)定流；在流量0.12～1.45ml時壓強波動較大，可達9mmHg，認為是波動流。以0.6dyn/cm2作用24h的后條件下，通過MTT實驗顯示培養(yǎng)在正壓和負壓狀態(tài)下的細胞組OD值分別是0.261±0.030、0.282±0.034，P=0.291。在正壓流組、負壓流組、空白對照組中，CD31免疫組化PU

8、值為13.21士0.19、9.84±0.26、0.56±0.36，正壓流組和負壓流組相比P=O.001。因此將平行板流動腔壓強由負壓調整為正壓后對細胞增殖無明顯影響，而對BM-MSCs的內皮細胞表型分化有促進作用，應用該裝置和適宜的刺激條件將更有利于利用流體應力促進MSCs誘導分化的研究。 3、流體應力對兔BM-MSCs向血管內皮細胞表型分化的影響 倒置相差顯微鏡觀察：實驗組1、實驗組2在細胞接種后呈纖維樣細胞結構，作用

9、24h大部分細胞呈鋪路石狀，細胞數量較兩個對照組少；而陽性對照組中(VEGF誘導組)細胞同時存在短梭形和鋪路石樣細胞；空白對照組中細胞仍呈梭形。 透射電鏡觀察：在實驗組1、實驗組2和陽性對照組發(fā)現(xiàn)特征性W-P小體，在空白對照組中未見該結構。 免疫組織化學染色：實驗組1、實驗組2、陽性對照組和空白對照組中，細胞CD31圖像分析4組樣本的PU值分別為11.38±0.83、12.10±0.82、11.06±0.67、1.42±

10、0.26，實驗組1、和實驗組2、陽性對照組之間相比P＞0.05，但較空白對照組P＜0.05；細胞Ⅷ因子圖像分析4組樣本的PU值分別為15.68±1.41、15.16±0.75、14.07±0.95、1.02±0.60，實驗組1、和實驗組2、陽性對照組之間相比P＞0.05，但較空白對照組P＜0.05。 Tube-forming實驗：實驗組1、實驗組2和陽性對照組細胞都能在鼠尾膠原凝膠上成小管；形成的小管樣結構平均長度分別：實驗組1

11、為364.21±10.31mm/cm2、實驗組2為442.92±19.62mm/cm2、陽性對照組為360.06±9.78mm/cm2、空白對照組為14.35±11.59mm/cm2，實驗組1、實驗組2和陽性對照組較空白對照組P＜0.05，差異有顯著性；實驗組1較陽性對照組P＞0.05；實驗組2較實驗組1和陽性對照組P＜0.05。 因此通過透射電鏡觀察和免疫組織化學分析，表明流體應力、VEGF和兩者聯(lián)合應用均能促進兔BM-MSC

12、s表達CD31和Ⅷ因子，并產生特異性的W-P小體，從而具有血管內皮細胞表型。通過Tube-forming實驗，提示流體應力、VEGF和兩者聯(lián)合應用后的誘導細胞，在體外具有與血管內皮細胞類似的生物學功能；流體應力和VEGF聯(lián)合應用可能更有利于誘導細胞表達生物學功能。 4、VEGFmRNA表達：通過RT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)，實驗組1、實驗組2、陽性對照組和陰性對照組各組之間VEGFmRNA表達無顯著性差別，切應力并未使得兔BM-MSCs