人胎盤來源的間充質(zhì)干細胞向血管內(nèi)皮細胞分化潛能的研究.pdf

1、目的：
　　 促進血管新生、改善微循環(huán)是治療缺血性疾病如冠狀動脈硬化性心臟病、腦血管疾病和周圍動脈閉塞性疾病的關(guān)鍵?！爸委熜匝苌伞笔悄壳靶绿岢龅母拍頪1],其與傳統(tǒng)的藥物、介入外科手術(shù)等治療手段不同,是通過模擬體內(nèi)血管生成機制來達到促進血管新生,改善側(cè)支循環(huán)的目的。其中種子細胞來源是血管組織工程的瓶頸,而內(nèi)皮細胞(endothelial cells,ECs)是組織工程化血管中急需解決的種子細胞之一。目前已有研究者從不同干細胞

2、分化ECs,如胚胎干細胞[2]、胚胎的成血管細胞[3]、內(nèi)皮前體細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)和多潛能成體干細胞[4],但這幾種細胞系在體內(nèi)含量很少,且受各種因素限制不易獲得。2004年,Oswald[5]等人首次成功在體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)向血管內(nèi)皮細胞分化,因此,MSCs可能成為分化為內(nèi)皮細胞理想的種子細胞來源。但人骨髓中的MSC

3、s含量極低,大約1×104～1×105個單核細胞中含有1個MSC[6],并且在嚴重感染、骨髓惡性腫瘤或隨著年齡增長的情況下,骨髓MSCs數(shù)量及增殖、分化能力均明顯下降。2004年,Fukuchi等[7]從成熟胎盤小葉中獲得MSCs,后來證明胎盤來源的MSCs(placenta derived mesenchymal stem cells,PDMSCs)具有和骨髓來源的MSCs相似的形態(tài)學(xué)、免疫表型和功能特點[8]。我們實驗室也證明PDM

4、SCs具有向脂肪、軟骨、骨和神經(jīng)分化的潛能。胎盤作為產(chǎn)后“廢棄物”,對其研究不涉及倫理道德問題,且來源豐富。目前國內(nèi)外尚未見PDMSCs向血管內(nèi)皮細胞分化。因此,本實驗將體外分離培養(yǎng)獲得的PDMSCs經(jīng)VEGF和bFGF體外誘導(dǎo)向血管內(nèi)皮細胞分化,并在誘導(dǎo)過程中的不同時間點檢測內(nèi)皮特異性抗原的表達變化和分化的ECs在體外形成血管的能力,為臨床上應(yīng)用PDMSCs移植治療缺血性疾病和構(gòu)建血管組織工程提供實驗依據(jù)。
　　 方法：

5、>　　 1、PDMSCs的分離、純化和擴增 采用組織塊種植法提取原代,無菌條件下剪碎胎盤組織,然后均勻接種至10cm培養(yǎng)皿,加含10％FBS的DMEM10ml,37℃、5％CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng),每3d換液一次,待細胞爬出生長至培養(yǎng)皿底部面積的70％-80％時去組織塊傳代,傳2-3代,紅細胞、成纖維細胞等混雜細胞即消失。本實驗選取第3代PDMSCs進行誘導(dǎo)分化及檢測。
　　 2、流式細胞儀分析 收集第3代PDMSCs,細胞

6、計數(shù)后取各管為1×106細胞,滴加PE標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體CD105、CD34和FITC標(biāo)記的CD166、CD31、CD4520ul,分別設(shè)PE、FITC、空白對照組,4℃避光孵育30 min,冰PBS洗滌1次,棄上清,加入200 ul PBS吹打混勻細胞,流式細胞儀檢測。
　　 3、體外ECs誘導(dǎo)分化培養(yǎng) 選擇傳代純化后培養(yǎng)生長良好的第3代PDMSCs,調(diào)整細胞濃度為3×104cells/ml和1.5×105cells/m1

7、.分別接種于35mm培養(yǎng)皿和60mm培養(yǎng)皿中,加內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基,置于37℃、5％CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng),每4d換一次新鮮誘導(dǎo)液。
　　 4、光鏡下觀察PDMSCs形態(tài)變化 在光學(xué)倒置顯微鏡下觀察PDMSCs誘導(dǎo)后形態(tài)學(xué)變化、增殖情況及排列方式,對比0d、4d、8d、12d的變化。隔天觀察一次。
　　 5、免疫細胞化學(xué)染色 以3x104cells/ml密度接種于35mm培養(yǎng)皿中,加誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng),分別于分化

8、第0d、4d、8d、12d用免疫細胞化學(xué)染色法檢測內(nèi)皮特異性標(biāo)志CD31、CD144/VE-cadherin、KDR、vWF的蛋白表達情況。棄去培養(yǎng)基,PBS洗3遍4％多聚甲醛固定30min,滴加一抗,4℃孵育過夜,滴加二抗,37℃孵育30min。顯微鏡下觀察拍照。
　　 6、透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu) 誘導(dǎo)后的細胞用0.25％Trypsin-EDTA消化后,1％鋨酸固定,0.1mol/L PBS漂洗三次,酒精、丙酮梯度脫水:30

9、％酒精-50％酒精-70％酒精-80％丙酮-90％丙酮-100％丙酮。環(huán)氧樹脂浸透、包埋,超薄切片70nm。JEM-1200EX鏡下觀察并拍照。
　　 7、體外血管生成實驗 用體外血管生成試劑盒,觀察在半固體Matrix上誘導(dǎo)7d的細胞形成毛細血管樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的能力。將Matrix置于4℃融化,24孔板每孔鋪200ul ECMatrix,37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱孵育2h,將誘導(dǎo)7d的PDMSCs以5×104/孔接種到半固體培養(yǎng)基

10、上,2h后開始在倒置顯微鏡下觀察細胞形成管狀結(jié)構(gòu)的形態(tài)。
　　 結(jié)果：
　　 1、PDMSCs的原代培養(yǎng)結(jié)果 胎盤組織塊接種后,約7d-10d組織塊周圍可見梭形和小圓形兩種貼壁細胞。隨著細胞密度的增加,細胞逐漸變成梭形單層細胞,呈漩渦狀排列,胞體變得大而扁平,形態(tài)類似于成纖維細胞。約14d-21d,細胞生長至70％-80％去組織塊傳代培養(yǎng),傳代細胞穩(wěn)定生長。
　　 2、流式細胞儀檢測 第3代PDMSCs高表達MS

11、Cs的表面標(biāo)志CD105(92.87％)和CD166(72.40％),不表達造血系統(tǒng)特異標(biāo)志CD34和白細胞共同抗原CD45,也不表達內(nèi)皮細胞特異的表面標(biāo)志CD31。
　　 3、細胞形態(tài)學(xué)和排列方式觀察 在倒置和相差顯微鏡下觀察,誘導(dǎo)分化的細胞形態(tài)呈鵝卵石樣,且細胞排列具有一定方向性,呈管腔狀、輪輻狀、條帶狀生長,且細胞呈首尾相接連接在一起。
　　 4、免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果
　　 (1)CD31在ECs分化過程的

12、表達變化 在PDMSCs向ECs誘導(dǎo)分化的過程中,CD31在4d出現(xiàn)微量表達,但與0d相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),隨著細胞不斷分化,于分化8d CD31表達顯著增強,明顯高于0d、4d、12d(P<0.05),12d表達減弱。
　　 (2)VE-cadherin/CD144在ECs分化過程的表達變化 在PDMSCs向ECs誘導(dǎo)分化的過程中,CD144呈時間依賴性地表達于細胞與細胞之間的粘著小帶,在誘導(dǎo)分化的0d和4d有微量

13、表達,二者相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),于分化8d和12d,細胞與細胞之間CD144陽性染色的棕黃色顆粒出現(xiàn)逐漸增多的趨勢。圖像分析表明,PDMSCs向ECs誘導(dǎo)分化的8d和12d,細胞的積分光密度值(IOD)與其他三組有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),表明CD144可作為內(nèi)皮終末分化的標(biāo)志來鑒定成熟階段的內(nèi)皮細胞。
　　 (3)vWF在ECs分化過程的表達變化 在PDMSCs向ECs誘導(dǎo)分化的過程中,vWF在0d有微量表

14、達,4d表達增強,8d達高峰,之后穩(wěn)定表達。圖像分析表明,PDMSCs向ECs誘導(dǎo)分化的8d和12d,細胞的積分光密度值顯著高于0d和4d(P<0.05)。
　　 (4)Flk-1/KDR在ECs分化過程的表達變化 Flk-1作為內(nèi)皮細胞的早期標(biāo)志,在0d即有表達,4d表達最強,隨后表達降低。圖像分析表明,PDMSCs向ECs誘導(dǎo)分化的4d,細胞的積分光密度值顯著高于0d、8d和12d(P<0.05),0d、8d和12d三組間無

15、統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 5、PDMSCs誘導(dǎo)的ECs超微結(jié)構(gòu) 透射電鏡下觀察誘導(dǎo)8d的細胞,可以看見內(nèi)皮細胞典型的細胞膜穴樣凹陷和吞飲小泡,胞漿中可見內(nèi)皮特異性結(jié)構(gòu)Weibel-palade小體。此外,胞漿中可見較多線粒體、高爾基體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體等細胞器,提示細胞增殖分化旺盛,核膜和核仁清晰可見。
　　 6、PDMSCs源的內(nèi)皮細胞體外血管生成能力 誘導(dǎo)7d的內(nèi)皮細胞接種到細胞外基質(zhì)凝膠(ECMatri

16、gel)中,2h后相鄰的細胞伸出觸突彼此相連,并逐漸通過管狀結(jié)構(gòu)聯(lián)成網(wǎng)狀,5h-6h趨于典型,呈“毛細血管腔”樣結(jié)構(gòu),而未分化的PDMSCs呈散在的細胞,不能形成管樣結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)論：
　　 1、胎盤組織中可以分離出大量的PDMSCs。
　　 2、PDMSCs在體外可被誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細胞,且分化的內(nèi)皮細胞在體外具有遷移和血管形成能力。
　　 3、在PDMSCs向ECs分化過程中,內(nèi)皮特異性標(biāo)志Flk