OCILRP2信號(hào)協(xié)同LPS誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞成熟及功能性分化.pdf

1、研究背景和目的:
　　破骨細(xì)胞抑制凝集素相關(guān)蛋白2(OCILRP2)屬于C型凝集素相關(guān)(Clr)分子家族，選擇性表達(dá)在淋巴組織、活化的淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DC)，其配體NKRP1f也可以表達(dá)在活化的淋巴細(xì)胞和DC，而且在DC的表達(dá)是淋巴細(xì)胞的上百倍。研究發(fā)現(xiàn)在T細(xì)胞活化過程中，OCILRP2通過結(jié)合配體NKRP1f可以協(xié)同B7與CD28的相互作用，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖與IL-2的產(chǎn)生，阻斷OCILRP2受體信號(hào)可以抑制T淋巴細(xì)胞對(duì)抗

2、原刺激的反應(yīng)。雖然OCILRP2在DC中高表達(dá)，但有關(guān)OCILRP2在DC發(fā)育分化及功能中的作用目前還沒有相關(guān)報(bào)道。
　　DC作為體內(nèi)唯一能夠激活初始T淋巴細(xì)胞的抗原遞呈細(xì)胞(APC)，在連接固有免疫和適應(yīng)性免疫中起橋梁作用。DC的模式識(shí)別受體(PRR)通過識(shí)別病原相關(guān)分子模式(PAMP)或應(yīng)激細(xì)胞產(chǎn)生的危險(xiǎn)信號(hào)誘導(dǎo)DC成熟和啟動(dòng)免疫應(yīng)答。Toll樣受體(TLR)是DC重要的PRR，通過識(shí)別特定的PAMP可以有效地誘導(dǎo)DC成熟和免

3、疫應(yīng)答的發(fā)生，但是TLR活化信號(hào)同時(shí)還受到DC中其他眾多PRR信號(hào)的調(diào)節(jié)，有關(guān)OCILRP2信號(hào)在DC中對(duì)TLR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)目前也還沒有相關(guān)研究被報(bào)道。
　　為此，我們將通過研究OCILRP2信號(hào)在DC發(fā)育分化以及功能中的作用，探討OCILRP2信號(hào)調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的DC發(fā)育及功能性分化的機(jī)制，這將有助于指導(dǎo)DC疫苗的開發(fā)和應(yīng)用于臨床腫瘤及自身免疫性疾病的治療。
　　方法:
　　將表達(dá)OCILRP2胞外段和人IgG1

4、Fc段融合蛋白的pIg-CD5-OCILRP2載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，G418篩選建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。大量培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，收集培養(yǎng)上清，Protein A親和層析純化OCILRP2-Fc蛋白;應(yīng)用OCILRP2-Fc免疫家兔，制備兔抗血清，硫酸銨沉淀和protein G親和層析純化OCILRP2多克隆抗體。
　　分離獲取Balb/c小鼠（6-8周齡）骨髓細(xì)胞，采用重組的小鼠GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)DC產(chǎn)生，LPS(500ng/m

5、l)刺激細(xì)胞24h誘導(dǎo)DC成熟，在培養(yǎng)基中加入OCILRP2-Fc或OCILRP2抗體阻斷OCILRP2信號(hào)在DC發(fā)育分化中的作用。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志分子CD11c、MHC-Ⅱ、CD80和CD86在不成熟DC和成熟DC的表達(dá)，分析OCILRP2-Fc對(duì)DC發(fā)育分化的影響;流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC對(duì)FITC標(biāo)記的Dextran的吞噬情況，分析OCILRP2-Fc對(duì)DC抗原吞噬能力的影響;混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞增殖，分析OCILR

6、P2-Fc對(duì)DC激活T細(xì)胞能力的影響;ELISA和RT-PCR分別檢測(cè)LPS刺激DC后培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子濃度和細(xì)胞中細(xì)胞因子的mRNA水平，分析OCILRP2-Fc和OCILRP2抗體對(duì)DC分泌細(xì)胞因子的影響;EMSA檢測(cè)NF-κB的活化以及western blot檢測(cè)I-κB的降解，探討OCILRP2信號(hào)影響DC發(fā)育及功能的機(jī)制。
　　Balb/c小鼠腹腔注射20mg/kg體重的LPS，實(shí)驗(yàn)組提前2h預(yù)先注射5mg/kg體重的

7、OCILRP2抗體。通過觀察記錄小鼠的存活率，解剖小鼠稱量脾臟大小，并將肺臟組織進(jìn)行HE染色，分析OCILRP2抗體對(duì)小鼠存活以及對(duì)小鼠免疫反應(yīng)的影響。
　　結(jié)果:
　　建立了OCILRP2-Fc融合蛋白穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，其目的蛋白表達(dá)水平可以達(dá)到＞10mg/L，該細(xì)胞株經(jīng)多次傳代能夠維持穩(wěn)定的目的蛋白表達(dá)水平。將通過ProteinA親和層析純化獲得的OCILRP2-Fc進(jìn)行SDS-PAGE電泳可見一分子量為～55kDa的蛋白

8、條帶，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其可與山羊抗人IgG抗體結(jié)合。ELISA和Western blot檢測(cè)純化后的OCILRP2多克隆抗體，結(jié)果表明該抗體可以與OCILRP2-Fc和細(xì)胞裂解液中的OCILRP2發(fā)生特異性結(jié)合。
　　LPS結(jié)合ELISA的結(jié)果顯示LPS不能和OCILRP2-Fc相結(jié)合，說明LPS不是OCILRP2的配體。OCILRP2在LPS誘導(dǎo)的成熟DC的表達(dá)高于不成熟DC說明TLR4活化信號(hào)可以上調(diào)OCILR

9、P2的表達(dá)。OCILRP2-Fc阻斷OCILRP2受體信號(hào)后細(xì)胞表面標(biāo)志分子CD11c、MHC-Ⅱ、CD80和CD86在不成熟DC及LPS誘導(dǎo)的成熟DC的表達(dá)均明顯下調(diào)說明OCILRP2-Fc抑制了骨髓前體細(xì)胞向未成熟DC分化和抑制DC發(fā)育成熟。OCILRP2-Fc處理組DC的抗原吞噬能力和對(duì)T細(xì)胞的刺激能力降低，以及OCILRP2-Fc處理組DC培養(yǎng)上清中炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-12、TNF-α等的表達(dá)水平降低，說明OCILRP2

10、-Fc抑制了DC的功能。隨著OCILRP2-Fc濃度的提高DC培養(yǎng)上清中IL-12的分泌水平越低，說明這種抑制作用具有劑量依賴性。OCILRP2多克隆抗體與OCILRP2-Fc在抑制DC炎性細(xì)胞因子表達(dá)中具有相同的效應(yīng)，說明二者都可以通過阻斷OCILRP2受體信號(hào)發(fā)揮作用。OCILRP2-Fc處理組與對(duì)照組DC培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-10的分泌沒有差異，說明OCILRP2-Fc對(duì)DC的抑制作用不是通過IL-10發(fā)揮作用。western

11、blot結(jié)果顯示OCILRP2-Fc處理組DC中I-κB的降解減少，EMSA結(jié)果提示OCILRP2-Fc處理組DC中NF-κB的活化減少，說明OCILRP2-Fc通過影響NF-κB的活化發(fā)揮對(duì)DC的抑制作用。
　　注射LPS72h后，OCILRP2抗體組小鼠的存活率為71.4％，PBS對(duì)照組小鼠全部死亡;OCILRP2抗體組小鼠的脾臟(0.07±0.028g)明顯小于PBS對(duì)照組(0.12±0.026g)(p＜0.05);且OCI