抗腫瘤效應B細胞通過Fas-FasL途徑直接殺傷腫瘤細胞且受IL-10和IL-2調控.pdf

1、第一部分 IL-10調控4T1 TDLN B細胞的抗腫瘤效應
　　目的：調控B細胞（Bregs）是一種調控免疫功能的 B細胞，在腫瘤免疫中通過其分泌的I L-10來抑制機體的抗腫瘤功能。為了確定IL-10+TDLN B細胞或IL-10在 WT4T1 TDLN B細胞抑制4T1腫瘤細胞生長轉移中的作用，我們檢測 IL-10-/-和WT4T1 TDLN B細胞表達IL-10的情況，還比較了它們在體內和體外的抗腫瘤作用，以及I L-10

2、抗體對WT4T1 TDLN B細胞抗腫瘤效應的影響。
　　方法：為了獲得TDLNs，在4T1自發(fā)性乳腺癌肺轉移腫瘤模型中我們將1×1064T1腫瘤細胞（在0.1ml的 PBS中）皮下接種到同源的 WT和IL-10-/- BALB/c小鼠側腹下部靠近腹股溝的地方。4T1腫瘤細胞接種9天后，處死小鼠，無菌條件下收集TDLNs。小鼠 LNs則直接取至正常 BALB/c小鼠。然后通過 CD19+微磁珠純化分選得到TDLN B細胞和正常LN

3、 B細胞，再用抗CD40(2μg/ml)和LPS(5μg/ml)體外激活擴增 B細胞3-4天，此時的 TDLN B細胞為效應細胞。我們對激活之前和之后的TDLN B細胞、正常LN B細胞進行表型功能分析，激活之后的WT和IL-10-/-TDLN B細胞可以用來進行過繼性免疫治療研究和體外細胞毒性檢測。為了獲得4T1荷瘤小鼠，我們將5×1044T1腫瘤細胞皮下接種到正常小鼠的乳腺脂肪墊中，誘導生成自發(fā)性肺轉移腫瘤小鼠。14天后，通過尾靜脈

4、輸入3或15×106效應 WT和IL-10-/-TDLN B細胞對這些荷瘤小鼠進行治療，或是輸入107效應 WT TDLN B細胞和IL-10抗體。28-29天后，處死所有的荷瘤小鼠并收集其肺和計算肺轉移結節(jié)數(shù)，還要收集脾和外周血，并檢測每組小鼠的脾 T、B細胞，PBMCs T、B細胞在體外的細胞毒性作用。
　　結果：我們比較了純化于WT和IL-10-/-4T1 TDLNs以及正常 LNs中的CD19+ B細胞，細胞流式檢測確定

5、CD19+和CD19+IL-10+ B細胞群，結果顯示磁珠分選后的CD19+ B細胞純度大于95％，且純化后的 WT B細胞中有2-3%的細胞是 CD19+IL-10+，而正如我們所預料的那樣在 IL-10-/- B細胞中幾乎沒有 IL-10+細胞存在。在體外用 LPS和抗CD40激活擴增培養(yǎng)后，WT B細胞中CD19+IL-10+的細胞增加到了11%左右，但在 IL-10-/- B細胞中仍然沒有 CD19+IL-10+的細胞存在。另外

6、，在激活擴增之前和之后的正常淋巴結 B細胞中，也幾乎不含有 CD19+IL-10+細胞。我們還對比了 WT4T1 TDLN B細胞和IL-10-/-4T1 TDLN B細胞的免疫治療效果。和PBS空白對照組相比，僅IL-2或低劑量（3×106/mouse）WT4T1 TDLN B細胞治療并不能顯著性地減少肺轉移結節(jié)；高劑量（15×106/mouse）過繼性輸入WT4T1 TDLN B細胞能顯著性地抑制4T1腫瘤轉移到肺上（p<0.05）

7、。而且高劑量（15×106/mouse）WT4T1 TDLN B細胞和高劑量（15×106/mouse）IL-10-/-4T1 TDLN B細胞的抗腫瘤效果是相似的（p>0.05）。但是，與低劑量（3×106/mouse）WT4T1 TDLN B細胞相比較，過繼性輸入低劑量（3×106/mouse）IL-10-/-4T1 TDLN B細胞能顯著性地減少肺轉移結節(jié)（p<0.05）。在體外，IL-10-/-4T1 TDLN B細胞或WT4T

8、1 TDLN B細胞都不能顯著性地殺傷Renca和TSA，但是 WT4T1 TDLN B細胞以劑量依賴性的方式殺傷4T1腫瘤細胞。在效應細胞和靶細胞的比例為10:1和30:1時，WT4T1 TDLN B細胞和IL-10-/-4T1 TDLN B細胞分別殺傷4T1的效率是沒有顯著性區(qū)別的；但在比例為3:1時，IL-10-/-4T1 TDLN B細胞比WT4T1 TDLN B細胞殺傷4T1腫瘤細胞的效率更高（p<0.05）。而在4T1乳腺癌

9、自發(fā)性肺轉移腫瘤模型中，我們用IL-10抗體和WT4T1 TDLN B細胞過繼性輸入治療荷瘤小鼠，結果表明與單效應 WT TDLN B細胞或效應 WT TDLN B細胞加上IgG/IgG1相比，IL-10抗體和效應 WT TDLN B細胞能顯著性地減少乳腺癌的肺轉移（p<0.01）。收集各組小鼠脾和外周血，比較其T和B細胞的細胞毒性作用，
　　結果顯示：來源于WT4T1 TDLN B細胞和IL-10抗體治療組的PBMCs T細胞和

10、B細胞，它們比其它各對照組的T細胞和B細胞更能顯著性地殺傷4T1腫瘤細胞（p<0.05）；來源于WT4T1 TDLN B細胞和IL-10抗體治療組的脾T細胞和B細胞，它們也比其它各對照組的T細胞和B細胞更能顯著性地殺傷4T1腫瘤細胞（p<0.05）。
　　結論：在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在WT4T1 TDLN B細胞、IL-10-/-4T1 TDLN B細胞和正常LN B細胞中，只有WT B細胞在激活和擴增之后都含有IL-10+的B細胞

11、。在體外，TDLN B細胞能以腫瘤特異性的方式直接殺傷腫瘤細胞，且IL-10-/-4T1 TDLN B細胞具有更高的直接殺傷腫瘤細胞效率；在體內以單個細胞為單位時，IL-10-/-4T1 TDLN B細胞比WT4T1 TDLN B細胞具有更高的抗腫瘤免疫效率。用IL-10抗體去除體內的IL-10可增強免疫系統(tǒng)的抗腫瘤功能，從而提高效應WT TDLN B細胞對腫瘤細胞的生長轉移抑制作用。所以，在過繼性免疫治療中WT TDLN B細胞中的B

12、regs所生成的IL-10降低其抗腫瘤效應。
　　第二部分4T1 TDLN B細胞通過Fas/FasL途徑直接殺傷4T1腫瘤細胞且IL-2調控其在體內的抗腫瘤效應
　　目的：根據(jù)前期研究成果，我們已經證明效應 TDLN B細胞過繼性輸入能抑制腫瘤細胞的生長轉移，但其介導腫瘤細胞死亡的機制仍然不是很清楚。為了探討效應TDLN B細胞介導腫瘤細胞死亡的可能機制，我們檢測了 TDLN B細胞表達 FasL和IL-2R的情況以及Fa

13、sL和IL-2的作用。
　　方法：在4T1自發(fā)性肺轉移腫瘤模型中，為了獲得 TDLNs我們將4T1腫瘤細胞皮下接種到同源的WT和IL-10-/-BALB/c小鼠側腹下部靠近腹股溝的地方。4T1腫瘤細胞接種9天后，處死小鼠無菌條件下收集 TDLNs。然后通過 CD19+微磁珠分離純化得到TDLN B細胞，再用CD40抗體和LPS體外激活擴增B細胞3-4天，此時的B細胞為效應細胞。我們檢測了4T1腫瘤細胞 Fas的表達情況和就體外 L

14、DH釋放來評估 Ant-FasL對效應 B細胞細胞毒性的作用。激活之前和之后的 TDLN B細胞可以用來進行表型功能分析。小鼠荷瘤14天后，對這些荷瘤小鼠進行治療，即尾靜脈輸入107個效應 TDLN B細胞，同時加入或不加入 IL-2。28-29天后，處死所有的荷瘤小鼠并收集其肺和計算肺轉移結節(jié)。
　　結果：為了確定4T1 TDLN B細胞直接殺傷4T1腫瘤細胞是否含有 Fas/FasL途徑，我們通過檢測LDH釋放來評估4T1 T

15、DLN B細胞對4T1腫瘤細胞的細胞毒性作用，另外還同時用anti-FasL阻斷FasL。結果顯示，4T1 TDLN B細胞和4T1腫瘤細胞共培養(yǎng)8-12小時后，在E:T的比例為10:1和30:1時，與10μg/ml anti-FasL抗體相比，30μg/ml anti-FasL抗體能顯著性地降低4T1 TDLN B細胞的殺傷效率。流式檢測 IL-10-/-和WT4T1 TDLN B細胞的FasL表達情況，結果表明anti-CD40/L

16、PS激活培養(yǎng)WT4T1 TDLN B細胞后，有大約5%細胞表達FasL，而表達FasL的IL-10-/-4T1 TDLN B細胞為8%左右。WT4T1 TDLN B細胞分別以10:1和30:1與4T1細胞培養(yǎng)12 h后，表達FasL的B細胞從5.1%分別增加到13.5%和18.0%；IL-10-/-4T1 TDLN B細胞則分別增加到16.2%和14.3%。檢測Fas在4T1腫瘤細胞上的表達時，結果發(fā)現(xiàn)幾乎所有的4T1腫瘤細胞都表達 F

17、as。另外，為了探討 IL-2在效應 B細胞過繼性免疫治療腫瘤中的作用，我們比較了WT4T1 TDLN B細胞或WT4T1 TDLN B細胞+IL-2對腫瘤的治療效果。結果顯示WT4T1 TDLN B細胞并不能抑制腫瘤轉移，但是WT4T1 TDLN B細胞和IL-2治療能顯著性地抑制了4T1腫瘤細胞從乳腺脂肪墊中轉移到肺上（p<0.01）；與無治療組相比，僅 IL-2并不能顯著性地減少肺轉移灶（p>0.05）。單 IL-2或單4T1 T

18、DLN B細胞都沒有體內抗腫瘤功能，只有兩者結合起來才能抑制腫瘤生長轉移。因此，我們檢測了4T1 TDLN B細胞 IL-2R（CD25）的表達，激活之前 WT和IL-10-/-4T1 TDLN B細胞都有大約10%的細胞 IL-2R+；體外激活擴增后，WT和IL-10-/-4T1 TDLN B細胞中IL-2R+的細胞又都增加了，分別提高到16.7%和17.9%。
　　結論：通過研究我們發(fā)現(xiàn)，IL-10-/-和WT4T1 TDLN

19、 B細胞都表達FasL且并沒有太大區(qū)別，和4T1細胞共培養(yǎng)后，表達FasL的B細胞都明顯地增加，4T1腫瘤細胞表達Fas。所以4T1 TDLN B細胞表面的FasL能與4T1腫瘤細胞表面的Fas結合并誘導4T1死亡，所以 TDLN B細胞通過Fas/FasL途徑殺死腫瘤細胞；它們還表達 IL-2受體（IL-2 receptor，IL-2R/CD25），且 IL-2是效應 TDLN B細胞在體內抑制腫瘤生長轉移的必要條件。IL-2可能是直

20、接調控作用于 TDLN B細胞。這些結果說明了效應TDLN B細胞在過繼性免疫治療中的機制包含了Fas/FasL途徑和IL-2調控。
　　第三部分過繼性輸入B細胞的體內追蹤研究
　　目的：我們已經證實了效應TDLN B細胞可以分泌IL-10，抑制其抗腫瘤效應，B細胞還通過Fas/FasL途徑介導腫瘤細胞死亡，且B細胞表達IL-2R、IL-2使效應TDLN B細胞具有在體內抗腫瘤的功能。但是，效應 TDLN B細胞在過繼性輸入

21、后，在體內遷移定位我們仍是不清楚。為了確定效應 TDLN B細胞在體內的遷移定位，在效應TDLN B細胞過繼性輸入前被標記以便于我們對B細胞進行體內的追蹤定位。
　　方法：為了獲得TDLNs，我們將4T1腫瘤細胞接種到WT BALB/c小鼠側腹下部靠近腹股溝的地方，4T1腫瘤細胞接種9天后，處死小鼠無菌條件下收集 TDLNs。然后通過 CD19+微磁珠純化分離得到 TDLN B細胞，再用 CD40抗體和LPS體外激活擴增B細胞3-

22、4天，此時的B效應細胞再被10μM CMTMR37℃避光孵育45 min。荷瘤小鼠4T1腫瘤細胞接種14天后，通過尾靜脈對這些荷瘤小鼠或正常小鼠輸入標記的TDLN B細胞，分別在過繼性輸入后第1、5、9和14天時，處死荷瘤小鼠和正常小鼠并收集其腫瘤、肺、脾和TDLN是，流式檢測這些組織器官中的標記TDLN B細胞和計算其數(shù)目。
　　結果：為了了解效應 TDLN B細胞在體內的定位，CMTMR標記 TDLN B細胞后進行其體內追蹤。

23、在輸入前結果表明 CMTMR100%標記效應 TDLN B細胞。在過繼性治療第1、5、9、14天時，流式檢測這小鼠的 TDLNs、脾、肺和腫瘤中活的標記CD19+ B細胞。結果顯示過繼性輸入 B細胞在第9天時，乳腺脂肪墊腫瘤和肺中所有CD19+ B細胞中所占的比例明顯較高。而且在第14天能明顯觀察到腫瘤肺轉移時，輸入的B細胞在腫瘤和肺總B細胞中仍占較高比例，而過繼性輸入B細胞在TDLN和脾中所占比例一直都比較低。另外，與在荷瘤小鼠肺中輸

24、入的 B細胞相比，在正常小鼠肺中只有很低比例的 TDLN B細胞。根據(jù)流式結果計算4種組織器官中過繼性 B細胞的實際數(shù)目，雖然過繼性B細胞在脾和TDLN的總B細胞中所占百分比較低，但是其實際數(shù)目卻比腫瘤和肺中的明顯要多一些（p>0.05）。
　　結論：這些結果證明過繼性B細胞并不是優(yōu)先遷移到腫瘤的，但是過繼性B細胞比內源性 B細胞更易于遷移到肺和腫瘤中。過繼性 TDLN B細胞可能直接作用于原發(fā)性腫瘤和轉移性腫瘤細胞來抑制腫瘤細胞