乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNAs的研究.pdf

1、乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響著全世界女性的身心健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)：2010年美國(guó)新發(fā)惡性腫瘤中，乳腺癌病人占到26％；并且，乳腺癌在所有惡性腫瘤病人的死亡率中占據(jù)第三位。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因，但腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制目前尚不明了。迄今為止，文獻(xiàn)報(bào)道了大量乳腺癌發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的癌基因或抑癌基因，這些基因在乳腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。近來(lái)，微小RNA(microRNA，miRNA)由于其在調(diào)

2、控基因表達(dá)方面的重要作用，成為新的研究熱點(diǎn)。
　　 miRNAs一類長(zhǎng)約18～22 nt的單鏈RNA，它不編碼任何蛋白質(zhì)，具有強(qiáng)大的調(diào)控基因表達(dá)作用。研究表明，miRNAs廣泛表達(dá)于各個(gè)物種和組織中，并在很多生理病理過(guò)程中，如細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡和代謝以及腫瘤發(fā)生發(fā)展和腫瘤轉(zhuǎn)移中均扮演了重要角色。miRNAs通過(guò)與特定mRNA結(jié)合導(dǎo)致其降解或通過(guò)調(diào)節(jié)特定mRNA的蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程來(lái)抑制其翻譯，從而負(fù)性調(diào)控靶基因表達(dá)。所以，在

3、腫瘤中miRNAs根據(jù)其靶基因的不同可以相應(yīng)發(fā)揮癌基因或者抑癌基因的角色。目前，在多種常見(jiàn)惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了異常的miRNAs表達(dá)，并且其表達(dá)與腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性相關(guān)。如：乳腺癌miR-335能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，并且其表達(dá)量與患者無(wú)轉(zhuǎn)移生存期呈正相關(guān)，提示其可能扮演了抑癌基因的角色；而miR-10b在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，并且具有促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的功能，提示其可能扮演了癌基因的角色。然而，miRN

4、As在乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的研究剛剛起步，其生物學(xué)作用和分子機(jī)制尚不明朗。
　　 在本研究中，我們將在不同侵襲特性的乳腺上皮細(xì)胞中篩選差異性表達(dá)的miRNAs，然后在體外研究中探索這些候選miRNA對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移等生物學(xué)行為的影響及其分子機(jī)制，同時(shí)我們將在臨床乳腺樣本中檢測(cè)這些miRNAs的表達(dá)，分析其與乳腺癌患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，從而探索乳腺癌侵襲相關(guān)的miRNAs，為將來(lái)合理治療乳腺癌提供新的生物學(xué)靶點(diǎn)。<

5、br>　　 第一部分不同侵襲力乳腺上皮細(xì)胞差異性miRNA表達(dá)譜的研究
　　 目的：檢測(cè)不同侵襲力人乳腺上皮細(xì)胞株中miRNAs的表達(dá)譜，分析差異性表達(dá)的miRNAs，篩選出可能與乳腺癌細(xì)胞侵襲力相關(guān)的miRNAs。
　　 方法：應(yīng)用高通量miRNA芯片(miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)11.0版)檢測(cè)人乳腺上皮細(xì)胞株HBL100、乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-468和MDA-MB-231中miRNA的表達(dá)譜，通過(guò)圖像分析

6、和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法，篩選出差異性表達(dá)的miRNAs。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)方法驗(yàn)證miRNA芯片結(jié)果，同時(shí)進(jìn)一步在臨床人乳腺病變(良性病變和乳腺癌)組織中檢測(cè)miRNAs表達(dá)狀況。
　　 結(jié)果：將miRNA芯片分組為①低侵襲乳腺細(xì)胞組--HBL100和MCF-7，②高侵襲乳腺癌細(xì)胞組--MDA-MB-231和MDA-MB-468。對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行SAM分析，根據(jù)兩組細(xì)胞miRNA相對(duì)表達(dá)量的差異和趨勢(shì)

7、，我們篩選出18個(gè)可能與乳腺癌細(xì)胞侵襲相關(guān)的miRNAs，其中7個(gè)miRNAs在高侵襲力乳腺癌細(xì)胞組顯著上調(diào)，11個(gè)miRNAs在高侵襲乳腺癌力細(xì)胞組顯著下調(diào)。我們選擇其中顯著下調(diào)的miR-339-5p和miR-340為進(jìn)一步研究對(duì)象，real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示它們?cè)趦山M乳腺細(xì)胞和新鮮乳腺組織中表達(dá)狀況與miRNA芯片一致。
　　 結(jié)論：侵襲力不同的乳腺上皮細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜存在差異性表達(dá)，提示miRNAs可能參

8、與了乳腺癌侵襲行為的調(diào)控。
　　 第二部分 miR-339-5p和miR-340對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲生物學(xué)行為作用的研究
　　 目的：檢測(cè)miR-339-5p和miR-340對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的生物學(xué)行為的作用。
　　 方法：以乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231為研究對(duì)象，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)分別將miR-339-5p和miR-340的抑制物(ASO)和模擬物(mimic)轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，檢測(cè)乳腺

9、癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲行為的改變。使用原位分子雜交方法檢測(cè)臨床存檔石蠟包埋的乳腺癌和乳腺良性病變組織中miR-339-5p和miR-340表達(dá)，并且分析其與乳腺癌臨床病理特征和患者預(yù)后的關(guān)系。
　　 結(jié)果：過(guò)表達(dá)miR-339-5p和miR-340可以顯著抑制高侵襲乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231遷移和侵襲，下調(diào)內(nèi)源性miR-339-5p和miR-340表達(dá)可以顯著促進(jìn)低侵襲乳腺癌細(xì)胞MCF-7的遷移和侵襲。上述兩種miRNA對(duì)乳

10、腺癌細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響。臨床乳腺癌組織中miR-339-5p和miR-340表達(dá)較良性病變組織表達(dá)顯著下調(diào)，并且它們表達(dá)量與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期等呈顯著負(fù)相關(guān)，與患者預(yù)后生存期呈正相關(guān)。
　　 結(jié)論：miR-339-5p和miR-340在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮了重要作用，是乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。
　　 第三部分 miR-339-5p和miR-340抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲分子機(jī)制的研究

11、　　 目的：探索miR-339-5p和miR-340抑制人乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲生物學(xué)行為的分子機(jī)制。
　　 方法：利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-339-5p和miR-340可能的靶基因，從中篩選可能參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移相關(guān)的潛在靶基因。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染外源性miR-339-5p和miR-340 ASO或mimics后，通過(guò)real-timePCR及western-blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后潛在靶基因mRNA和蛋白表達(dá)?？寺∧?/p>

12、標(biāo)基因3’UTR，將其與質(zhì)粒psiCHECK-2(含熒光素酶報(bào)告基因)連接后，與miR-339-5p和miR-340 mimics分別共轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，進(jìn)行熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(Luciferase ReporterAssay)驗(yàn)證它們的靶基因。
　　 結(jié)果：在miR-339-5p和miR-340眾多潛在靶基因中，分別選取BCL-6和c-Met為研究對(duì)象。轉(zhuǎn)染miR-339-5p和miR-340的ASO或mimics后，BCL-6和