Caveolin-1調(diào)控HER-2活化對乳腺癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分:Caveolin-1在乳腺癌組織中的表達及與臨床病理特征的相關(guān)性
　　目的:
　　本研究擬應(yīng)用免疫組化、體外培養(yǎng)細胞、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、免疫蛋白印跡等實驗技術(shù)，探討Caveolin-1參與乳腺癌的作用及其可能機制，從細胞、組織和分子水平綜合分析Caveolin-1對HER-2磷酸化的調(diào)控，探討Caveolin-1在Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路中的作

2、用，為闡明乳腺癌發(fā)病機制提供新的實驗數(shù)據(jù)，為有效預(yù)防和治療乳腺癌提供新的靶點。
　　方法:
　　1.采用非生物素酶二步(PV)免疫組織化學(xué)方法，檢測50例分化程度不同的浸潤性乳腺癌組織及正常乳腺組織中Caveolin-1的表達，探討其與乳腺癌臨床生物學(xué)行為的關(guān)系及對預(yù)后的意義。
　　2.了解Caveolin-1和磷酸化人類表皮生長因子受體2(p-HER-2)的表達情況，以正常乳腺組織或乳腺良性增生為陰性對照。
　

3、　結(jié)果:
　　1.免疫組化檢測Caveolin-1、HER-2、Ki-67在乳腺癌組織中的表達免疫組化結(jié)果顯示，Caveolin-1的陽性表達產(chǎn)物主要分布于乳腺上皮細胞的胞漿，呈現(xiàn)黃色-棕褐色顆粒。按判定標準Caveolin-1在正常乳腺組織中陽性表達的程度較強，在浸潤性乳腺癌組織中表達較少，其表達率分別為80％和32％，兩者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Ki-67的陽性表達產(chǎn)物主要分布于乳腺上皮細胞的胞核，HER-2的

4、陽性表達產(chǎn)物主要分布于乳腺上皮細胞的胞膜，呈現(xiàn)黃色-棕褐色顆粒。
　　2.Caveolin-1、HER-2、 Ki-67的表達與乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Caveolin-1在浸潤性乳腺癌中的表達水平隨淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移而減低(P＜0.05)，隨臨床TNM分期而減低(P＜0.05)，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Caveolin-1在浸潤性乳腺癌中的表達水平與患者年齡、腫瘤直徑、ER/PR、HER-2、Ki-67、及絕經(jīng)前

5、后等表達無關(guān)。
　　第二部分：Caveolin-1影響乳腺癌細胞生物學(xué)行為的的分子機制
　　目的：
　　探討Caveolin-1影響乳腺癌細胞生物學(xué)行為的的分子機制
　　方法:
　　1.細胞復(fù)蘇和培養(yǎng)
　　將MDA-MB-453細胞凍存管從液氮中取出，融化后用含10％胎牛血清、青霉素100IU/ml、鏈霉素100IU/ml的1640培養(yǎng)基在37℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2.質(zhì)粒提取<

6、br>　　用QIAGEN質(zhì)粒提取試劑盒，分別提取pcDNA3.1-Cav1和pcDNA3.1陰性對照質(zhì)粒，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞。設(shè)置MDA-MB-453組、pcDNA3.1-Cav1（Cav-1）轉(zhuǎn)染組和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染對照組，加嘌呤霉素進行抗性篩選，未轉(zhuǎn)染組細胞全部死亡。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Cav1質(zhì)粒的MDA-MB-453細胞即MDA-MB-453/Cav-1，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒的MDA-MB-453細胞即MDA-MB-45

7、3/pcDNA3.1。
　　3.Western blot和實時定量PCR驗證過表達Caveolin-1效果
　　培養(yǎng)MDA-MB-453、MDA-MB-453/Cav-1和MDA-MB-453/pcDNA3.1細胞，待細胞長滿至培養(yǎng)皿的80％左右，用無胎牛血清的1640培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)4小時，收集細胞提取總蛋白，采用免疫印跡(Western-blot)法測定不同乳腺癌細胞中Caveolin-1蛋白的表達情況。
　　將MD

8、A-MB-453/Cav-1細胞MDA-MB-453/pcDNA3.1細胞和MDA-MB-453細胞分別接種于35mm培養(yǎng)皿中，利用實時定量PCR檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中Caveolin-1 mRNA的表達水平。
　　結(jié)果:
　　1.乳腺癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞MDA-MB-453的Caveolin-1表達情況
　　1.1Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細胞Caveolin-1的蛋白表達水平Western blot檢測轉(zhuǎn)染后MDA-

9、MB-453細胞Caveolin-1的蛋白水平。MDA-MB-453、MDA-MB-453/pcDNA3.1和MDA-MB-453/Cav-1細胞Caveolin-1的表達水平分別為0.02±0.00，0.02±0.00，0.60±0.03，MDA-MB-453/Cav-1細胞Caveolin-1的表達水平明顯高于對照組，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　1.2實時定量PCR檢測Caveolin-1的mRNA的表達水平
　

10、　實時定量PCR檢測MDA-MB-453穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞Caveolin-1 mRNA的表達水平。MDA-MB-453、MDA-MB-453/pcDNA3.1和MDA-MB-453/Cav-1細胞Caveolin-1的mRNA表達水平分別為1.00±0.00、1.12±0.05、7.09±0.43，MDA-MB-453/Cav-1細胞Caveolin-1的表達水平明顯高于對照組(1.00)，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　

11、　2.乳腺癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞MDA-MB-453的增殖情況
　　將乳腺癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞MDA-MB-453接種于96孔板，分別經(jīng)0nM、4nM、20nM、100nM刺激后，MTT法檢測各孔的OD值進行統(tǒng)計分析，MDA-MB-453/Cav-1組的OD值為0.80±0.07，0.86±0.03，0.93±0.03，1.00±0.03，均明顯低于對照組的OD值0.93±0.05，1.02±0.04，1.12±0.06，1.32±0.09，有

12、顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。
　　第三部分：Caveolin-1對乳腺癌細胞HER-2活化的影響
　　目的：
　　探討Caveolin-1對乳腺癌細胞HER-2活化的影響
　　方法:
　　Western blot檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的Caveolin-1、4G10、HER-2、p-Akt、Akt、p-ERK、ERK、β-actin的蛋白表達情況。
　　實驗分為兩組:pcDNA3.1-Cav1轉(zhuǎn)染組和p

13、cDNA3.1轉(zhuǎn)染對照組，培養(yǎng)并用嘌呤霉素篩選乳腺癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDA-MB-453/pcDNA3.1和MDA-MB-453/Cav-1細胞，每組分別于EGF刺激0min、5min、10min、30min后收集細胞，提取蛋白，Western-blot檢測各時間點Caveolin-1、4G10、HER-2、p-Akt、Akt、p-ERK、ERK、β-actin蛋白的表達情況，統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:
　　過表達Caveolin-1對

14、乳腺癌細胞HER-2活化的影響
　　統(tǒng)計結(jié)果顯示，pcDNA3.1-Cav1組各時間點Caveolin-1的表達水平（1.12±0.03，1.08±0.06，1.13±0.06，1.11±0.04）均明顯高于對照組(0.05±0.01，0.04±0.01，0.04±0.00，0.04±0.01)的表達水平，均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);pcDNA3.1-Cav1組磷酸化HER-2分別于EGF刺激5min、10min、30min后

15、的表達水平（0.98±0.04，0.50±0.03，0.20±0.01）均明顯低于對照組（1.25±0.03，1.07±0.03，0.50±0.02）的表達水平，均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);pcDNA3.1-Cav1組磷酸化Akt分別于EGF刺激5min、10min、30min后的表達水平（0.50±0.01，0.67±0.03，0.42±0.01）均明顯低于對照組（0.85±0.05，1.20±0.08，0.82±0.04）的表達

16、水平，均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);pcDNA3.1-Cav1組磷酸化ERK分別于EGF刺激5min、10min、30min后的表達水平（0.58±0.01，0.80±0.03，0.45±0.01）均明顯低于對照組（0.93±0.02，1.10±0.06，0.72±0.05）的表達水平，均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.Caveolin-1在正常乳腺上皮細胞高表達;Caveolin-1在浸潤性乳腺癌組織