99Tcm-survivin mRNA反義肽核酸在人肺癌A549荷瘤裸鼠體內(nèi)分布及顯像研究.pdf

1、目的：通過制備99Tcm標記的survivin mRNA反義肽核酸(PNA)探針，并進行人肺癌A549荷瘤裸鼠的體內(nèi)分布及基因顯像實驗，觀察反義探針在荷瘤裸鼠體內(nèi)分布情況及在腫瘤組織部位的放射性聚集程度，探討基因顯像早期診斷腫瘤的可行性，為核素基因顯像技術(shù)在腫瘤早期診斷方面進一步臨床性研究提供實驗室依據(jù)。
　　 方法：選用survivin mRNA的第240-251位寡核苷酸片段為靶序列，利用化學合成法合成與其互補的反義肽核酸片

2、段5’-CCCAGCCTTCCA-3’，于5’端連上4個氨基酸組成的短肽結(jié)構(gòu)(Gly-(D)-Ala-Gly-Gly-)，形成1個類似N4結(jié)構(gòu)的強螯合基團，為消除空間阻礙，引入1個Υ-氨基丁酸(Aba)作為隔離物，然后利用配體交換法進行99Tcm標記。以同樣方法對無義肽核酸片段5’-TACCGTCTGCGA-3’進行99Tcm標記。采用高效液相色譜法(HPLC)對標記物進行鑒定，測定標記物的保留時間及放射性化學純度。以純乙腈為展開劑，分

3、別用聚酰胺凝膠膜和快速硅膠紙兩種快速薄層層析法(ITLC)對標記物即刻標記率進行綜合測定，并測定與人新鮮血清37℃保溫24小時后的標記率，檢測探針的體外穩(wěn)定性。采用貼壁法培養(yǎng)人肺癌A549細胞，收獲對數(shù)生長期的細胞，制備成1×107個/0.2ml生理鹽水的單細胞懸液，接種到4周齡的雌性裸鼠的右前肢皮下，約14天后成瘤，待腫瘤直徑長至1～1.5cm時，選取腫瘤形態(tài)規(guī)則，色澤紅潤，中心無壞死的荷瘤裸鼠納入實驗。利用Rt-PCR實驗檢測人肺癌

4、A549細胞及腫瘤組織中survivin基因mRNA的表達情況。細胞攝取率及滯留率實驗初步探討反義肽核酸在肺癌A549細胞中的藥代動力學作用。抽取30只荷瘤裸鼠，隨機分為反、無義體內(nèi)分布組，每組又分為1、2、4h三個亞組，各5只，每只荷瘤裸鼠經(jīng)尾靜脈注射99Tcm標記的survivin mRNA反義或無義PNA(740kBq/0.1ml)后，分別于1、2、4h將對應(yīng)各組荷瘤裸鼠眼靜脈采血，處死并解剖各組織或臟器，分別測定血液、心臟、肝臟

5、、脾臟、腎臟、肺臟、胃、腸道、腦、骨骼、肌肉及腫瘤等組織的重量及放射性計數(shù)，并測定相同時刻標準源的放射性計數(shù)，計算每克組織中放射性計數(shù)占標準源總放射性計數(shù)的比值(％ID/g)，計算腫瘤組織與肌肉組織的％ID/g的比值(T/M)。抽取A549荷瘤裸鼠10只，隨機分為反、無義兩組，各5只，每只荷瘤裸鼠經(jīng)尾靜脈注射99Tcm標記的survivin mRNA反義或無義PNA(37MBq/0.1ml)后，進行1、2、4h上機顯像，觀察兩組間顯像的

6、差異。利用感興趣區(qū)技術(shù)(ROI)測得腫瘤組織與對側(cè)正常組織的放射性計數(shù)的比值(T/NT)。所有計量資料均以x±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件對組間數(shù)據(jù)進行兩個樣本的成組t檢驗，P＜0.05統(tǒng)計學差異有顯著性。
　　 結(jié)果：99Tcm-survivin mRNA反義PNA經(jīng)HPLC檢測標記物呈單峰，保留時間約為12分鐘，與survivin mRNA反義PNA的紫外峰保留時間基本一致。兩種ITLC法綜合檢29Tcm-surv

7、ivin mRNA反義PNA即刻標記率為95.48％±1.92％(n=5)，與人新鮮血清37℃保溫24小時后標記率仍＞85％。無義PNA即刻標記率及體外穩(wěn)定性與反義PNA基本相同。
　　 Rt-PCR實驗結(jié)果表明人肺癌A549細胞及腫瘤組織中均高表達survivin基因。細胞攝取實驗結(jié)果顯示A549細胞對兩種肽核酸的攝取無明顯統(tǒng)計學差異，腫瘤細胞與反義肽核酸在相互作用1h后有一個較穩(wěn)定的平臺期。3h內(nèi)細胞對兩種肽核酸都有一定的清

8、除作用，無義組較反義組清除快，兩組在60及120分鐘時細胞滯留率差異有統(tǒng)計學意義。
　　 荷瘤裸鼠體內(nèi)分布結(jié)果表明99Tcm-survivin mRNA反義PNA在腫瘤組織內(nèi)分布明顯高于肌肉組織。此外，腎臟和肝臟中的放射性分布最高。反義組1、2、4h腫瘤組織的％ID/g分別為2.51士1.20、1.52士0.16、1.35士0.27。計算反義、無義兩組各時刻T/M值，組間結(jié)果顯示4h時差異有統(tǒng)計學意義。
　　 反義基因顯

9、像顯示99Tcm-survivin mRNA反義PNA在腫瘤部位特異性聚集，隨著時間的延長，聚集程度也相對逐漸增加，4h時腫瘤組織部位顯像最清晰。利用ROI技術(shù)測得的1、2、4h小時T/NT值分別為2.70士0.28、3.44士0.35、4.21±0.63。此外荷瘤裸鼠腹腔有一定的放射性聚集。無義PNA在腫瘤部位中僅稍有放射性核素聚集，顯像過程中聚集程度變化不明顯。4h時反義、無義兩組間T/NT值差異有統(tǒng)計學意義，與體內(nèi)分布中T/M比值