99Tcm-VEGF125-136-MAG3多肽片段的制備及其在骨肉瘤荷瘤裸鼠體內(nèi)分布與顯像研究.pdf

1、目的:制備99Tcm標(biāo)記的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF125-136)多肽片段探針，并進(jìn)行其在人骨肉瘤MG63荷瘤裸鼠的體內(nèi)分布及腫瘤受體顯像的實(shí)驗，評估99Tcm-VEGF125-136的體外穩(wěn)定性，體內(nèi)代謝過程及顯像特征，以尋找一種腫瘤特異性分子探針，能夠反映腫瘤組織血管生成活性，為腫瘤的早期診斷及靶向治療提供實(shí)驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、VE

2、GF125-136-MAG3的合成與標(biāo)記
　　 采用自動多肽合成儀常規(guī)固相法合成目標(biāo)多肽QKRKRKKSRYKS，并在合成過程中直接完成與巰基乙酰基三甘氨酸(MAG3)的偶聯(lián)，形成VEGF125-136-MAG3，然后進(jìn)行99Tcm標(biāo)記，尋找最佳標(biāo)記條件。利用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）及紙層析法測定標(biāo)記物的即刻標(biāo)記率，對標(biāo)記物進(jìn)行鑒定。同時將標(biāo)記物于室

3、溫中放置1h、2h、6h、12h，采用紙層析法測定其標(biāo)記率，檢測該標(biāo)記物的體外穩(wěn)定性。
　　 2、人骨肉瘤MG63荷瘤裸鼠動物模型的建立
　　 復(fù)蘇人骨肉瘤MG63細(xì)胞株，采用貼壁法，DMEM高糖培養(yǎng)基（含10％的滅活胎牛血清）培養(yǎng)，收獲對數(shù)生長期的細(xì)胞，制備成約5×107個/ml細(xì)胞濃度的單細(xì)胞懸液，按0.2ml/只接種到3～4周齡的雌性裸鼠的左側(cè)前肢根部背側(cè)。裸鼠在無特殊病原體級(specifc pathogen f

4、ree，SPF)環(huán)境中飼養(yǎng)，待腫瘤長至0.8cm～1.0cm時，選取腫瘤形態(tài)較規(guī)則，中心無壞死的骨肉瘤荷瘤裸鼠模型納入實(shí)驗。取少量瘤體組織，10％甲醛固定，進(jìn)行病理學(xué)鑒定。
　　 3、99Tcm-VEGF125-136-MAG3在人骨肉瘤MG63荷瘤裸鼠體內(nèi)分布研究取20只骨肉瘤荷瘤裸鼠，隨機(jī)分為4組:0.5h組、1h組、2h組、4h組，每組5只，分別經(jīng)尾靜脈注射18.5MBq的99Tcm-VEGF125-136-MAG3，并于

5、注射后0.5h、1h、2h、4h按組心臟取血后將荷瘤裸鼠處死。取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、腸道、肌肉、骨、腦等主要臟器及腫瘤組織，用生理鹽水沖洗干凈后濾紙吸干水分，電子天平準(zhǔn)確測量主要臟器及腫瘤組織的質(zhì)量并用單道γ井型計數(shù)器測量其放射性計數(shù)，取相同注射劑量的99Tcm-VEGF125-136-MAG3作99Tcm的衰變校正，計算所取標(biāo)本的每克組織中放射性計數(shù)占標(biāo)準(zhǔn)源總計數(shù)的比值(％ID/g);計算腫瘤組織與對側(cè)肌肉組織（正常組織

6、）的％ID/g的比值(tumor to muscle ratios，T/M)。
　　 4、99Tcm-VEGF125-136-MAG3在人骨肉瘤MG63荷瘤裸鼠內(nèi)腫瘤顯像研究
　　 取5只骨肉瘤荷瘤裸鼠作為實(shí)驗組，經(jīng)尾靜脈注射18.5MBq的99Tcm-VEGF125-136-MAG3，另取5只荷瘤裸鼠作為競爭性抑制組，同樣經(jīng)尾靜脈注射18.5MBq的99Tcm-VEGF125-136-MAG3(注射前0.5h先注射VE

7、GF125-136-MAG3200μg)，兩組分布于注射后0.5h、1h、2h、4h進(jìn)行腫瘤受體顯像，利用感興趣區(qū)技術(shù)(region of interest，ROI)以對側(cè)肌肉組織作為非靶（正常）組織，計算不同時間點(diǎn)腫瘤組織與對側(cè)正常組織的放射性計數(shù)的比值(T/NT)，比較兩組間相同時間點(diǎn)顯像的差異。
　　 5、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 所有計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件，以P

8、＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、99Tcm-VEGF125-136-MAG3的制備與鑒定
　　 在北京中科亞光有限公司幫助下采用自動多肽合成儀常規(guī)固相法直接完成VEGF125-136-MAG3的合成。在標(biāo)記反應(yīng)總體積為125μl，多肽含量為20μg，99Tcm為3.7×107Bq的條件下，酒石酸鉀鈉用量為10μl(500μg)，氯化亞錫用量為5μg時標(biāo)記物的標(biāo)記率較高，在此標(biāo)記條件下經(jīng)H

9、PLC法分析，99Tcm-VEGF125-136-MAG3呈單峰，即刻標(biāo)記率大于96％。經(jīng)紙層析法檢測，標(biāo)記物的即刻標(biāo)記率為(97.80±1.46)％(n=5)，室溫下靜置12h后標(biāo)記率仍大于為85％。99Tcm-VEGF125-136-MAG3即刻標(biāo)記率高，無需純化，穩(wěn)定性較好。
　　 2、荷瘤裸鼠模型的觀察與鑒定
　　 腫瘤位于荷瘤裸鼠左前肢根部背側(cè)，大約1～2周成瘤，3～4周肉眼觀察腫瘤長至約0.8cm～1.0cm

10、左右，瘤體呈結(jié)節(jié)狀，質(zhì)硬，剝離瘤體觀察，腫瘤位于皮下與肌肉間，瘤體顏色呈魚肉色，表面光滑。
　　 3、99Tcm-VEGF125-136-MAG3在骨肉瘤MG63荷瘤裸鼠體內(nèi)分布研究結(jié)果
　　 99Tcm-VEGF125-136-MAG3在血液中代謝速率較快，注射后0.5h放射性攝取為(0.23±0.01)％，注射后4h為（0.09±0.01）％;其早期在腎臟內(nèi)分布最高，其次肝臟及胃腸道內(nèi)分布較高，并且呈逐漸下降趨勢;9

11、9Tcm-VEGF125-136-MAG3在腫瘤內(nèi)的放射性計數(shù)比值1h時達(dá)最高為(0.28±0.02)％，隨后逐漸下降;各組內(nèi)腫瘤組織的％ID/g值各時間點(diǎn)均高于肌肉組織，其T/M值分別為1.60±0.05，3.04±0.07，2.33±0.05，1.70±0.04，以1h時T/M值最高。
　　 4、99Tcm-VEGF125-136-MAG3的荷瘤裸鼠腫瘤顯像結(jié)果:
　　 實(shí)驗組荷瘤裸鼠注藥后0.5h時腫瘤部位隱約顯影

12、，1h時在腫瘤部位出現(xiàn)明顯放射性濃聚，而后其放射性濃聚程度逐漸下降。利用ROI技術(shù)測得0.5h、1h、2h、4h的T/NT值分別為1.16±0.14、3.10±0.19、2.63±0.14、1.90±0.09。競爭性抑制組各時間點(diǎn)腫瘤部位未見明顯放射性濃聚，其各時間點(diǎn)的T/NT值分別為0.99±0.05、1.06±0.06、0.98±0.03、0.97±0.03。
　　 5、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 對實(shí)驗組與競爭性抑制組組間相

13、同時間點(diǎn)T/NT值進(jìn)行組間成組t檢驗，結(jié)果顯示1h、2h、4h時P值均小于0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:99Tcm-VEGF125-136-MAG3的即刻標(biāo)記率高，體外穩(wěn)定性較好;該標(biāo)記物血液清除較快，主要經(jīng)腎臟代謝，不通過血腦屏障，可被高度表達(dá)VEGF的骨肉瘤組織攝取;該標(biāo)記物能夠順利進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，特異地濃聚于骨肉瘤荷瘤裸鼠種植瘤內(nèi)，未喪失其生物學(xué)活性，且與VEGF受體仍具有較高的親和力。99Tcm-VEGF125