通過阻斷ICOS-B7h的供體B細(xì)胞預(yù)輸注誘導(dǎo)心臟移植耐受的實驗研究.pdf

1、【背景】
　　供體特異性輸注（Donorspecifictransfusion，DST）泛指在圍移植術(shù)期通過給予受體輸注供體來源的全血、脾淋巴細(xì)胞或其他細(xì)胞成分，從而延長移植物存活的一種治療手段，至今已有30多年的研究歷史。新近的多項研究表明，通過DST協(xié)同共刺激阻斷（包括CD28/B7和CD40/CD40L）的治療，在嚙齒類動物模型中成功誘導(dǎo)移植耐受。ICOS作為CD28超家族中的第三成員，其配體B7h組成表達(dá)于B細(xì)胞表面。IC

2、OS/B7h信號在排斥反應(yīng)中的重要作用已為學(xué)界所公認(rèn)。靜息狀態(tài)的B細(xì)胞是一種良好的供體抗原輸注成分，有研究表明缺失共刺激能力的B細(xì)胞具有良好的致耐受性（Tolerogenic）。因此我們設(shè)想通過重組的ICOSIg融合蛋白在體外與供體來源的B細(xì)胞預(yù)孵育，從而阻斷其與受體T細(xì)胞間的ICOS/B7h信號，并利用這種方式的DST進(jìn)行相關(guān)的體內(nèi)、體外實驗研究。
　　【方法】
　　1.體外實驗，通過流式細(xì)胞術(shù)確定ICOSIg與B細(xì)胞結(jié)合

3、的飽和濃度，通過單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測ICOSIg靶定的B細(xì)胞刺激反應(yīng)性T細(xì)胞增殖的能力。
　　2.分別以BALB/c和C57BL/6小鼠為供、受體，建立小鼠頸部異位心臟移植模型，流式細(xì)胞術(shù)檢測移植術(shù)后受體外周淋巴器官中ICOS的表達(dá)，對移植物進(jìn)行組織病理學(xué)監(jiān)測（包括HE、Masson、IHC染色）。
　　3.移植術(shù)前給予受體ICOSIg靶定的供體B細(xì)胞和/或ICOSIg預(yù)輸注。對于移植物存活超過100d的受體，進(jìn)行第三方

4、供體皮片移植實驗，鑒定耐受的供體特異性。
　　4.夾心ELISA法檢測耐受鼠血清中Th1/Th2類細(xì)胞因子的濃度。
　　5.RT-PCR法檢測長期存活的移植物內(nèi)Th1/Th2類細(xì)胞因子mRNA的水平。
　　6.流式細(xì)胞術(shù)檢測耐受鼠外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞的亞群比例，檢測移植術(shù)后7d受體引流淋巴結(jié)內(nèi)T細(xì)胞的凋亡情況。
　　7.通過磁珠分離法獲取耐受鼠脾臟來源的不同細(xì)胞亞群，分別將其過繼性轉(zhuǎn)移給經(jīng)300rad

5、60Co預(yù)照射的正常受體，24hr后給予同品系供體來源之心臟移植，觀察轉(zhuǎn)移性耐受的形成與否。
　　【結(jié)果】
　　1.重組ICOSIg融合蛋白與小鼠脾淋巴細(xì)胞能夠良好結(jié)合，其飽和濃度在100μg/ml左右。
　　2.在體外，ICOSIg靶定的B細(xì)胞無法刺激反應(yīng)性T細(xì)胞的正常增殖；受體APCs呈遞的ICOS/B7h信號可以部分恢復(fù)反應(yīng)性T細(xì)胞的增殖活性；比較而言，直接識別途徑的ICOS/B7h信號似乎對于T細(xì)胞的增殖作用更

6、為顯著。
　　3.成功建立小鼠頸部異位心臟移植模型。通過ICOSIg靶定的供體B細(xì)胞預(yù)輸注（ITBT）可以顯著延長移植心在受者體內(nèi)的存活，當(dāng)且僅當(dāng)ITBT和ICOSIg聯(lián)合預(yù)處理后，75％的移植物存活超過100天。誘導(dǎo)獲得之耐受具有供體特異性。
　　4.耐受鼠的外周淋巴器官及移植物中均有不同程度的ICOS+細(xì)胞亞群存在，其外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞的亞群比例顯著高于對照組（15.6±5.69％，P＜0.01）。

7、　　5.與對照相比，ITBT+ICOSIg預(yù)處理的受體移植術(shù)后7d，其引流淋巴結(jié)中CD8+T細(xì)胞凋亡比例顯著高于對照組（19.53±5.10％，P＜0.05）。
　　6.與正常對照相比，未處理組受體移植術(shù)后7d，血清中IFN-γ水平顯著提高（600.2±400.0pg/mlVS172.6±70.7pg/ml，P＜0.05），而耐受鼠血清中IL-10水平則顯著低于正常對照（563.5±153.7pg/mlVS2063.3±367.9

8、pg/ml，P＜0.005）.
　　7.與未處理組移植后7d的移植物相比，耐受鼠移植物內(nèi)IL-2在mRNA水平低表達(dá)（IL-2Ratio：0.344±0.021，P＜0.05），而IL-10表達(dá)水平上調(diào)，（IL-10Ratio：0.910±0.038，P＜0.05）。
　　8.在過繼性轉(zhuǎn)移實驗中證實，經(jīng)＞10×106TSCs預(yù)輸注，可誘導(dǎo)300rad60Co預(yù)照射的正常受體產(chǎn)生轉(zhuǎn)移性耐受，進(jìn)一步分群發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)轉(zhuǎn)移性耐受產(chǎn)生的調(diào)

9、節(jié)性細(xì)胞主要集中于CD4+T細(xì)胞亞群內(nèi)，然而相同劑量的CD4+CD25-TSCs（5×106）預(yù)輸注則無法介導(dǎo)轉(zhuǎn)移性耐受產(chǎn)生。
　　9.去除移植物后1個月，“耐受鼠”脾細(xì)胞介導(dǎo)轉(zhuǎn)移性耐受的效率降低。
　　【結(jié)論】
　　1.體外實驗結(jié)果顯示，ICOSIg靶定的供體B細(xì)胞無法有效地刺激受體反應(yīng)性，這表明直接識別途徑中的ICOS/B7h信號，對于T細(xì)胞的正常增殖是不可或缺的。同時我們注意到，雖然通過間接識別途徑呈遞的該信號也

10、可促進(jìn)T細(xì)胞增殖，但與直接途徑相比，其作用似乎較弱。
　　2.體內(nèi)實驗中，我們通過ICOSIg靶定的供體B細(xì)胞和ICOSIg的同時輸注，成功誘導(dǎo)了MHC完全不匹配小鼠的供體特異性心臟移植耐受。
　　3.耐受的誘導(dǎo)及維持是一個動態(tài)調(diào)節(jié)的過程。通過預(yù)輸注，我們在移植后7d受體的引流淋巴結(jié)內(nèi)，找到了CD8+T細(xì)胞凋亡的證據(jù)。然而關(guān)于耐受的維持，無論是在外周血（CD4+CD25+T細(xì)胞比例），在移植物（Th1/Th2類細(xì)胞因子的mR