間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合骨髓細(xì)胞輸注誘導(dǎo)大鼠胰島移植免疫耐受.pdf

1、本文擬應(yīng)用鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）糖尿病大鼠模型進(jìn)行同種異體胰島移植，以供體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合骨髓細(xì)胞共同靜脈預(yù)輸注的方法，觀察胰島移植物的存活時(shí)間，了解間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)過程，糖尿病大鼠胰島移植物的存活時(shí)間及參與的淋巴細(xì)胞類型、細(xì)胞因子變化，為探索胰島移植后免疫耐受的方法開辟多種途徑。 課題分以下三個(gè)部分 一、大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及免疫學(xué)特性的研究 目的：體外分離培養(yǎng)和純

2、化骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，研究其體外的生物學(xué)特性和對(duì)免疫細(xì)胞功能的影響及初步機(jī)制。 方法：①改良式單純貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察獲得各代細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞的生長曲線，流式細(xì)胞儀檢測(cè)第三代細(xì)胞生長周期、細(xì)胞表面標(biāo)記，誘導(dǎo)成骨和成脂肪分化。②間充質(zhì)干細(xì)胞與脾淋巴細(xì)胞共同體外培養(yǎng)，檢測(cè)共培養(yǎng)體系中淋巴細(xì)胞增殖、凋亡和淋巴細(xì)胞亞群的變化；檢測(cè)共培養(yǎng)體系上清液中細(xì)胞因子的變化。 結(jié)果：①骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞呈

3、長梭形，貼壁生長，細(xì)胞周期G0～G1期占（81.8±2.8）%；流式細(xì)胞儀鑒定干細(xì)胞的標(biāo)志陽性：CD44（99.83%）、CD90（99.67%）；造血干細(xì)胞的標(biāo)志表達(dá)陰性：CD34（0.48%），白細(xì)胞共同抗原CD45（0.05%）及CD11b（0.1%）。成骨和成脂肪誘導(dǎo)可以使BM-MSCs出現(xiàn)鈣鹽沉積和脂滴，分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。②骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與脾淋巴細(xì)胞按不同比例共同培養(yǎng)：MSC：L（M/L）為1：1、1：10和1：50

4、時(shí)，可以明顯抑制同種異基因來源的淋巴細(xì)胞增殖，明顯抑制共培養(yǎng)體系中CD8+T淋巴細(xì)胞的比例，但并不影響體系中CD4+T淋巴比例和淋巴細(xì)胞凋亡率。M/L為1：1時(shí)可以增加共培養(yǎng)體系中CD4+CD25/CD4+的比例。③上清液細(xì)胞因子檢測(cè)顯示INF-γ、IL-10及IL-6高表達(dá)，IL-2及TNF-α中度表達(dá)，IL-4、IL-1α、IL-1β低度表達(dá)。M/L為1：10和1：50組上清液IFN-γ水平下降；M/L1：10組上清液IL-6水平升

5、高，而TNF-α水平下降。 結(jié)論：體外培養(yǎng)可以獲得大量生物學(xué)特性均一的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在體外具有抑制淋巴細(xì)胞增殖，調(diào)整T淋巴細(xì)胞亞群的作用，機(jī)制可能是通過部分細(xì)胞因子來實(shí)現(xiàn)。 二、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在異基因正常大鼠體內(nèi)的分布和對(duì)活體免疫功能的影響 目的：研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞輸注后在體內(nèi)的分布情況和對(duì)活體正常同種異基因大鼠免疫功能的影響。 方法：①Wistar大鼠來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，CFSE染色后以

6、5×106/只經(jīng)尾靜脈注入SD大鼠體內(nèi)。分別在24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、1周及2周處死受體大鼠，取脾臟、肺、肝臟進(jìn)行冰凍切片，骨髓細(xì)胞涂片后熒光顯微鏡觀察，以及流式細(xì)胞術(shù)分析骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的分布情況。②24只SD大鼠隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組按5×106/只尾靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，對(duì)照組注射PBS。在注射后1，2，3，4周分別處死實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠各3只，取脾淋巴細(xì)胞行淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和單向混合淋巴反應(yīng)（MLR）。③20只SD

7、大鼠隨機(jī)分為4組，每組5只，每只大鼠分別通過尾靜脈注射5×106，5×105，5×104骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及1mlPBS。10天后處死全部大鼠行單向混合淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)分析大鼠外周血和脾臟淋巴細(xì)胞亞群的變化 結(jié)果：①注入細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)，BM-MSCs細(xì)胞聚集以肺為主；72小時(shí)后細(xì)胞聚集以脾臟和骨髓為主。在1周時(shí)脾臟、肝臟及骨髓內(nèi)仍然可以見到較多細(xì)胞；超過兩周后逐漸消失。②在ConA刺激下，實(shí)驗(yàn)組大鼠的脾淋巴細(xì)胞可以

8、正常增殖。在與SD大鼠來源的脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行MLR發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組大鼠1周、2周的OD值與正常對(duì)照組相比有顯著差異（P=0.000）。③不同濃度組的MLR結(jié)果表明，注射5×106細(xì)胞組脾淋巴細(xì)胞MLR受到抑制（P=0.000），外周血、脾臟CD4+T較對(duì)照組降低（P=0.014，P=0.009），外周血CD8+T較對(duì)照組降低（P=0.020），外周血和脾臟CD4+CD25+/CD4+均升高（P=0.009，P=0.006）。 結(jié)論：骨

9、髓間充質(zhì)干細(xì)胞在注射后短時(shí)間內(nèi)滯留以肺為主，在1周～2周后在脾臟和骨髓。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制作用受時(shí)間限制，超過2周后作用消失；且在體內(nèi)發(fā)揮作用要達(dá)到5×106以上，可以降低體內(nèi)CD4+T細(xì)胞亞群水平，部分降低CD8+，升高CD4+CD25/CD4+百分率。 三、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合骨髓細(xì)胞（BMC）輸注誘導(dǎo)胰島移植免疫耐受及其機(jī)制的研究 目的：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合骨髓細(xì)胞共同靜脈輸注誘導(dǎo)胰島移植免疫耐受的方法及作

10、用機(jī)制，為尋找誘導(dǎo)胰島移植免疫耐受的方法開辟新的途徑，提供新的依據(jù)。 方法：①建立糖尿病動(dòng)物模型：注射劑量按照35mg/kg·體重，連續(xù)5天。每周監(jiān)測(cè)隨機(jī)血糖3次，連續(xù)2周血糖超過16.7mmol/L以上者認(rèn)為造模成功。②大鼠胰島細(xì)胞的分離純化：采用膠原酶P胰管灌注消化，F(xiàn)icoll-400不連續(xù)梯度純化Wistar大鼠胰島；⑨嵌合體模型的建立：采用60Coγ射線全身照射，劑量為7Gy。全身照射（TBI）后4小時(shí)內(nèi)經(jīng)尾靜脈輸入B

11、M-MSCs/和BMC。移植術(shù)后14天定量PCR檢測(cè)嵌合率。④間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合骨髓細(xì)胞輸注對(duì)糖尿病胰島移植物的影響：以雄性Wistar大鼠為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞供體，雌性Wistar大鼠為骨髓細(xì)胞供體，雌性SD大鼠為胰島移植受體。將糖尿病SD大鼠隨機(jī)分為單純胰島移植（A組）、單純骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞5×106預(yù)輸注后胰島移植組（B組）、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞5×105+骨髓細(xì)胞1×107預(yù)輸注后胰島移植組（C組）及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞5×106+骨髓細(xì)胞

12、1×107預(yù)輸注后胰島移植組（D組）四組。各組在預(yù)處理7天后行胰島移植，將1000IEQ的胰島細(xì)胞移植入各組糖尿病大鼠的左腎包囊內(nèi)，比較各組移植物生存時(shí)間上的差異。同時(shí)各實(shí)驗(yàn)組分別在預(yù)處理后第7天（即胰島移植術(shù)前）、胰島移植術(shù)后7天、14天、21天、排斥后應(yīng)用放射免疫法測(cè)定大鼠血清胰島素水平。D組大鼠在不同的移植時(shí)期（包含血糖正常期、排斥期兩個(gè)時(shí)期）手術(shù)將移植物載體腎取出；其余各實(shí)驗(yàn)組在糖尿病SD大鼠移植物排斥后2天，取出其移植物載體腎

13、，做病理切片觀察。⑤對(duì)胰島移植糖尿病大鼠混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的影響：D組分別于移植耐受期和排斥后取大鼠脾臟，分離淋巴細(xì)胞，與絲裂霉素C處理的供體Wistar大鼠和無關(guān)第三品系F344/N大鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，MTT法觀察受體淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。⑥供體間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合骨髓細(xì)胞輸注對(duì)胰島移植糖尿病大鼠T淋巴細(xì)胞亞群及CD4+CD25+T細(xì)胞的影響：將糖尿病SD大鼠按上述方法分組，各組分別于預(yù)處理后第7天（即胰島移植術(shù)前）、胰島移

14、植術(shù)后7天、14天、排斥后取外周血及大鼠脾臟制備的淋巴細(xì)胞懸液，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD8+、CD4+、CD4+CD25+/CD4+T淋巴細(xì)胞比率。⑦骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合骨髓細(xì)胞輸注對(duì)胰島移植糖尿病大鼠細(xì)胞因子微環(huán)境的影響：各組分別于預(yù)處理后第7天（即胰島移植術(shù)前）、14天、排斥后取外周血清，應(yīng)用Luminex多功能流式點(diǎn)陣儀液相芯片法檢測(cè)白介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）、白介素-4（IL-4）、白介素-10（IL-10）

15、含量；同時(shí)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)外周血清轉(zhuǎn)移生長因子-β1（TGF-β1）含量。 結(jié)果：①以STZ（35mg/kg·體重）多次小劑量經(jīng)腹腔注射的方法，可成功誘發(fā)SD大鼠糖尿病，糖尿病模型建模成功率為98%；②胰島細(xì)胞獲取量及細(xì)胞活率：每條大鼠胰腺分離、純化后平均可獲取的胰島細(xì)胞團(tuán)數(shù)量為（1063.49±84.74）IEQ，純度>90%。胰島素釋放試驗(yàn)：低糖組的胰島素釋放量為（2.08±0.56）μIU/Islet，高糖組的釋放量

16、為（7.18±1.32）μIU/Islet。③14天時(shí)檢測(cè)外周血Y染色體含量檢測(cè)，提示只有D組外周血中含有少量的Y染色體，其余兩組均未檢測(cè)到。在骨髓、脾臟組織中，三組之間Y染色體含量有差異（P=0.027，P=0.039）D組的含量最高。④D組大鼠胰島移植物生存時(shí)間與其它三組比較具有顯著性差異（P=0.000），中位生存時(shí)間為30天，最長達(dá)32天。C組移植物生存時(shí)間也有所延長，中位生存時(shí)間為14天。 結(jié)論：①采用膠原酶P胰管灌注

17、消化，F(xiàn)icoll-400不連續(xù)梯度純化能分離、純化出較大數(shù)量且功能良好的大鼠胰島細(xì)胞。②骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞5×106+骨髓細(xì)胞1×107能顯著延長同種異體大鼠胰島移植物的存活時(shí)間。③以單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，預(yù)輸注供體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞5×106+骨髓細(xì)胞1×107的受體鼠淋巴細(xì)胞對(duì)供體淋巴細(xì)胞刺激的增殖反應(yīng)具有明顯抑制作用。④嵌合體檢測(cè)表明預(yù)輸注供體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞5×106+骨髓細(xì)胞1×107的受體鼠在血液、脾臟和骨髓形成嵌合體