間充質(zhì)干細胞聯(lián)合骨髓細胞輸注誘導胰島移植免疫耐受的研究.pdf

1、研究背景： 胰島移植重建胰島素分泌系統(tǒng)，是一種有望徹底根治糖尿病的治療方法。2000年，Edmonton方案的成功，標志著胰島移植取得了突破性的進展，從而帶動了胰島移植臨床試驗性治療在世界范圍內(nèi)廣泛展開。目前普遍認為，解決異體移植排斥反應(yīng)的關(guān)鍵在于誘導受體對供體的細胞、組織或器官產(chǎn)生免疫耐受。由于移植免疫耐受的機制十分復雜，盡管誘導免疫耐受的方法眾多，但均未能達到完全可靠持久的特異性耐受。持久耐受狀態(tài)的誘導需要穩(wěn)定混合嵌合狀態(tài)的

2、長期維持，是在移植受體內(nèi)供體來源的細胞和受體細胞的共存。在嚙齒類動物體內(nèi)通常通過中樞刪除機制達到混合嵌合狀態(tài)，使能夠維持長期的器官移植免疫耐受。然而傳統(tǒng)的骨髓細胞輸注仍然無法在人體內(nèi)實現(xiàn)有效的混合嵌合狀態(tài)，且非特異性免疫抑制劑的應(yīng)用，移植物功能的慢性喪失以及潛在致命性的移植物抗宿主反應(yīng)的發(fā)生，這些因素均限制著通過骨髓細胞嵌合體來達到器官移植耐受的臨床的應(yīng)用。 間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells，MSC)可以從

3、成熟的骨髓、脂肪組織、胎盤、頭皮和多種胎兒組織中獲得，具有向骨組織、軟骨和脂肪等的多能分化潛能。在體外實驗中還發(fā)現(xiàn)MSC在特定的培養(yǎng)條件下能夠向肌肉、肝細胞、內(nèi)皮細胞和神經(jīng)組織等分化，骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)條件下還可以轉(zhuǎn)分化為胰島素陽性細胞。MSC在心肌損傷的修復，骨代謝紊亂和多種代謝性疾病中顯示出很好的療效。近年來發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞還具有逃脫免疫識別和抑制免疫反應(yīng)的特性。通過阻斷共刺激通路誘導耐受和延長胰島移植物的存活亦受到廣泛關(guān)注，

4、抗CD154單克隆抗體在誘導混合嵌合體中發(fā)揮著重要的作用。它能夠有效的抑制活化的T細胞上CD40配基的表達并且阻止和抗原提呈細胞所表達受體的結(jié)合，阻止APC的上調(diào)MHC的作用，減少共刺激分子和細胞因子的表達。傳統(tǒng)的骨髓細胞移植做為誘導混合嵌合體和胰島移植耐受的手段的應(yīng)用已多年，并且成為最穩(wěn)定的成功措施。但是要獲得滿意的臨床療效又面臨著許多困難，諸如預(yù)處理的毒性、移植物抗宿主病和免疫低下等。 由于MSC容易從骨髓里分離和擴增，并具

5、有逃脫免疫識別和抑制免疫反應(yīng)的特性，所以我們擬應(yīng)用糖尿病小鼠模型進行同種異體胰島移植，抗CD154做為對受體預(yù)處理措施，并同時輸注間充質(zhì)干細胞和骨髓細胞，觀察其對同種異體小鼠胰島移植誘導混合嵌合狀態(tài)，及對胰島移植物存活時間的影響。 目的： 觀察MSC聯(lián)合骨髓細胞輸注對同種異體小鼠胰島移植誘導混合嵌合狀態(tài)，及對胰島移植物存活時間的影響，為尋找誘導胰島移植免疫耐受的方法開辟新的途徑、提供新的依據(jù)。 方法： 1

6、、MSC分離培養(yǎng)、擴增分別取C57BL/6小鼠和KM小鼠頸椎脫臼處死，用L-DMEM培養(yǎng)基沖洗出股骨內(nèi)的骨髓，首次24h換液后每3d換液，依據(jù)貼壁培養(yǎng)法分離和擴增MSC，取第4代細胞作為移植供源，調(diào)整細胞數(shù)2×106/ml。 2、供體骨髓細胞制備取出C57BL/6小鼠雙側(cè)股骨，用培養(yǎng)液沖出骨髓細胞，通過200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，收集后加入紅細胞裂解液去除紅細胞，離心去上清，再洗滌兩次用培養(yǎng)基重懸細胞調(diào)整8×107/ml備用。

7、 3、小鼠糖尿病模型的建立和胰島移植STZ(180mg/kg)經(jīng)腹腔一次性注射BALB/C小鼠，制備實驗性糖尿病模型(連續(xù)2次血糖>16.7mmol/L)；造模成功后的小鼠經(jīng)脊柱旁切口暴露左側(cè)腎臟，注入腎包囊下約500IEQ胰島。移植后1周每天監(jiān)測隨機血糖，以后隔日測1次血糖，連續(xù)兩次血糖水平大于11.1mmol/L，以第1次時間認為排斥反應(yīng)發(fā)生。 4、小鼠胰島細胞的分離純化摘取4只C57BL/6小鼠的胰腺，0.25mmPen

8、fine針對胰腺反復多點注射膠原酶P后靜止消化20min；采用自制的推進式離心管，以單一密度梯度Ficoll液(1.088g/ml)純化胰腺消化物，雙硫腙對胰島進行特異性染色，利用胰島素釋放試驗檢測胰島細胞的功能；純化后的胰島移植到實驗性糖尿病BALB/C小鼠的腎包囊下，術(shù)后觀察其血糖變化。 5、實驗分組和處理近交系C57BL/6小鼠(H-2Kd)和BALB/C小鼠(H-2Kb)分別為供體和受體，無關(guān)第三品系KM小鼠。A組：對照

9、組(單純進行胰島移植)；B組：供體MSC輸注；C組：供體骨髓細胞輸注；D組：供體骨髓細胞和MSC輸注；E組：供體骨髓細胞和第三品系的KM小鼠MSC輸注。每組各5只，均在胰島移植術(shù)后經(jīng)小鼠尾靜脈輸注上述細胞懸液。所有受體小鼠在胰島移植的同時腹腔注射500μg抗CD154單抗。 6、供體細胞嵌合率檢測移植后的第7、30、60d眼球采血100μl肝素抗凝后，加入紅細胞裂解液裂解紅細胞，離心移去上清。按1μg/106細胞加入FITC-H

10、-2Kb單抗，充分混勻后置4℃冰箱避光染色15-30min，PBS洗滌2次，加入PBS500μl重懸成單細胞懸液，流式細胞儀檢測。規(guī)定當嵌合率低于1％時表示混合嵌合狀態(tài)的結(jié)束。 7、對混合淋巴細胞反應(yīng)的影響按上述A、C、D各組的分組和處理措施進行胰島移植，糖尿病BALB/C小鼠分別于胰島移植術(shù)后7、30、60d取脾臟分離淋巴細胞，與ConA處理的供體C57BL/6小鼠淋巴細胞進行單向混合淋巴細胞培養(yǎng)，MTT法觀察受體淋巴細胞增殖

11、反應(yīng)。 結(jié)果： 1、MSC生長情況原代培養(yǎng)24h換液，可見少量貼壁細胞，形態(tài)不規(guī)則。原代及傳代培養(yǎng)的小鼠MSC多呈梭形，部分呈不規(guī)則樣，可見較多集落形成。培養(yǎng)至第3代的細胞呈現(xiàn)紡錘形、星形及不規(guī)則形等多種形態(tài)，細胞質(zhì)豐富，核仁明顯，細胞平行排列或漩渦狀生長。 2、純化單一密度梯度液純化后，共可得到(789.6±26.4)IEQ胰島，平均純度為(77.12±3.23)％。高糖刺激后胰島素釋放量為低糖的2.35倍[分

12、別為(12.72±1.08)μIU/ml和(5.41±0.53)μIU/ml,P<0.010]，提示胰島β細胞功能良好。 3、C組(53.00±12.98d)與A組(13.00±3.21d)相比胰島移植物存活時間顯著延長，表明單純骨髓細胞輸注能顯著減少排斥反應(yīng)。D組胰島移植物生存時間(77.00±8.23d)與C組相比均有顯著延長(p<0.010)，E組移植物生存時間(61.00±5.98d)與A、C兩組相比也有顯著性差異(P<

13、0.010)，說明MSC輸注均能有效的延長骨髓細胞誘導的移植免疫耐受。D組比E組移植物生存時間延長(P<0.050)，供體來源的MSC比其它來源的MSC更有效的延長移植物存活時間。B組移植物生存時間(15.00±6.19d)與A組相比沒有顯著性差異，單純MSC輸注并不能使移植物存活時間延長。 4、胰島移植后第7d，單純胰島移植組和MSC輸注組的DC水平都很低；其余三組均達到了混合嵌合體的水平。胰島移植后第30d，BMC輸注組DC

14、從(28.84±4.78)％下降到(15.26±2.31)％，其中1只小鼠的胰島功能喪失；而BMC和MSC同時輸注的D組和E組，DC下降不明顯，始終維持在25％以上，與C組相比差距有顯著意義(P<0.010)。移植后60d，C組DC只有(2.16±0.68)％，80％的胰島功能喪失；此時E組[(7.66±2.01)％]與D組[(13.50±2.25)％]的供體細胞嵌合率比較差距有顯著意義(P<0.010)，E組2只小鼠胰島功能喪失。隨時

15、間的延長受體體內(nèi)的DC逐漸下降，同時輸注MSC的D組比單純輸注BMC的C組下降趨于緩和。 5、混合輸注的D組在移植后30dBALB/C小鼠淋巴細胞對ConA處理的C57BL/6小鼠淋巴細胞的增殖反應(yīng)，較接受單純骨髓細胞輸注組明顯降低(P<0.010)，直至移植后60d抑制效應(yīng)仍為顯著。 結(jié)論： 1、貼壁法和連續(xù)傳代法相結(jié)合是一種簡單、有效和經(jīng)濟的分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞的方法。 2、改進的Penfine針對胰

16、腺反復多點注射和采用自制的推進式離心管以單一密度梯度Ficoll液純化胰腺消化物，所得胰島功能良好，大大簡化了傳統(tǒng)的對小動物進行胰島分離純化的繁瑣程序，提高了成功率。 3、MSC聯(lián)合骨髓細胞輸注比單純骨髓細胞輸注能夠更長時間的維持混合嵌合狀態(tài)，使胰島移植物存活時間延長。 4、供體來源的MSC輸注比非供體來源的MSC輸注有更有效的免疫抑制作用。 5、單向混合淋巴細胞培養(yǎng)實驗證實，混合輸注組的受體鼠淋巴細胞對供體淋巴