Htert-PUMA基因聯(lián)合作用對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖抑制和凋亡的研究.pdf

1、目的:構(gòu)建人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因RNA干擾表達(dá)載體,同時(shí)構(gòu)建p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子(PUMA)的促表達(dá)載體,探討hTERT基因及PUMA基因單獨(dú)和聯(lián)合作用對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖抑制和凋亡效應(yīng),為腫瘤聯(lián)合基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:設(shè)計(jì)針對(duì)hTERT基因的RNA干擾序列GGAACACCAAGAAGTTCATCT(1524-1544),合成具有該靶序列短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸,經(jīng)退火形成雙鏈DNA,用T4 DNA連接酶

2、連接到線性化pYr-2.1質(zhì)粒U6啟動(dòng)子下游,構(gòu)建成重組質(zhì)粒pYr-2.1-hTERT-shRNA。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α,經(jīng)搖菌擴(kuò)增,抽提純化質(zhì)粒,通過酶切及測(cè)序鑒定確定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。同法構(gòu)建不針對(duì)任何基因的陰性對(duì)照質(zhì)粒。另合成PUMA基因的表達(dá)序列克隆至pUC57載體上,構(gòu)建表達(dá)載體pUC57-PUMA并鑒定。把pUC57-PUMA和pYr-adshuttle-1分別用BamH I和EcoR I酶切,T4 DNA連接酶

3、連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pYr-adshuttle-1-PUMA,經(jīng)酶切鑒定確認(rèn)重組質(zhì)粒pYr-adshuttle-1-PUMA構(gòu)建成功。乳腺癌MCF-7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng),于轉(zhuǎn)染前一日接種于6孔板,將以上兩種載體的熒光對(duì)照質(zhì)粒pYr-2.1-EGFP和pYr-adshuttle-1-RFP分別單獨(dú)、聯(lián)合轉(zhuǎn)染入細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后48h,熒光顯微鏡下觀察綠色及紅色熒光細(xì)胞所占的比例,以此判斷轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)設(shè)置hTERT干擾組、PUMA表達(dá)組、hTERT／P

4、UMA聯(lián)合組、干擾陰性對(duì)照組(HK group)、表達(dá)陰性對(duì)照組(adshuttle-1 group)和空白組(blank group),將以上構(gòu)建的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞(空白組加等量PBS)。轉(zhuǎn)染后48h通過western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中hTERT和PUMA蛋白的相對(duì)表達(dá)量；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率和周期分布；CCK-8法于轉(zhuǎn)染后1～4d天檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況。
　　 結(jié)果:1.重組質(zhì)粒pYr-2.1-hTERT-

5、shRNA和pYr-adshuttle-1-PUMA經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定證實(shí)目的序列插入正確,重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.轉(zhuǎn)染后48h在熒光顯微鏡下觀察,根據(jù)熒光細(xì)胞所占比例判斷轉(zhuǎn)染效率均達(dá)60％左右。3.免疫印跡結(jié)果分析顯示:hTERT干擾組與空白組相比hTERT蛋白的相對(duì)表達(dá)量下降了54.4％；hTERT／PUMA聯(lián)合組與空白組相比hTERT蛋白的相對(duì)表達(dá)量下降了52.3％；PUMA表達(dá)組與空白組相比PUMA蛋白的相對(duì)表達(dá)量增加了168.4％

6、；hTERT／PUMA聯(lián)合組與空白組相比PUMA蛋白的相對(duì)表達(dá)量增加了158.6％。4.CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:hTERT組、PUMA組和hTERT／PUMA聯(lián)合組在1～4d內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、增殖顯著抑制；hTERT／PUMA聯(lián)合組對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用明顯強(qiáng)于hTERT組和PUMA組。5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布顯示:轉(zhuǎn)染后48h,hTERT組、PUMA組和hTERT／PUMA聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率分別為9.87％、19.

7、02％、31.46％,hTERT組和hTERT／PUMA聯(lián)合組的細(xì)胞周期阻滯于G0／G1期,PUMA組的細(xì)胞周期基本無變化,hTERT／PUMA聯(lián)合組比hTERT組和PUMA組細(xì)胞周期阻滯更明顯。
　　 結(jié)論:1.成功構(gòu)建針對(duì)hTERT基因的shRNA表達(dá)載體pYr-2.1-hTERT-shRNA,該載體可以特異性地抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞中hTERT基因的表達(dá)。2.成功構(gòu)建了針對(duì)PUMA基因的促表達(dá)載體pYr-adshuttl