金蓮花總黃酮抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖作用機(jī)制研究.pdf

1、乳腺癌是女性最常見(jiàn)的腫瘤，嚴(yán)重威脅女性的身心健康。每年全球約有超過(guò)100萬(wàn)的女性診斷為乳腺癌，同時(shí)有40萬(wàn)女性因此而死亡。歐美國(guó)家的乳腺癌發(fā)病率較高，我國(guó)的乳腺癌發(fā)病率近年來(lái)也呈上升趨勢(shì)。目前乳腺癌治療以手術(shù)為主，配合放、化療等綜合治療，但放、化療也帶來(lái)了嚴(yán)重的毒副反應(yīng)。因此臨床上急需尋找和開(kāi)發(fā)毒副作用小、療效好的抗乳腺癌腫瘤新藥物。
　　金蓮花是毛茛科植物金蓮花trollius chinensis的干燥花及花蕾，有清熱解毒的功效

2、，民間常用來(lái)治療扁桃體炎，口腔喉腫，急性腸炎等。
　　現(xiàn)代藥理研究表明，金蓮花總黃酮為其主要有效成份，具有很好的體內(nèi)外抗氧化，抗病毒，抗炎，抗菌，降壓和解痙等作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，金蓮花總黃酮對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有增殖抑制作用，但作用機(jī)制未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)利用HE染色，熒光顯微鏡，微分干涉，掃描電鏡，聚光共聚焦顯微鏡對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的形態(tài)進(jìn)行多途徑觀察。用western blot技術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)，闡述了細(xì)胞

3、凋亡的可能作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)抗乳腺癌新藥物提供動(dòng)力。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　實(shí)驗(yàn)分為正常組，溶劑對(duì)照組，藥物組(0，0.0991，0.1982，0.3964，0.7928，1.5856mg·mL1)，時(shí)間設(shè)定為24，48，72 h。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制率，微分干涉顯微鏡(DIC)的應(yīng)用從立體的角度進(jìn)一步直觀的證實(shí)細(xì)胞的凋亡，HE染色觀察細(xì)胞核和胞質(zhì)的變化，Hoechst33258熒光法觀察細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞核的變化，掃

4、描電鏡觀察細(xì)胞表面的變化，激光共聚焦通過(guò)標(biāo)記細(xì)胞膜表面磷脂酞絲氨酸蛋白和細(xì)胞核來(lái)反映細(xì)胞凋亡過(guò)程的變化。Western blot方法測(cè)定凋亡相關(guān)蛋白bcl-2，NF-κB，p53，caspase-3，9，F(xiàn)asL的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.金蓮花總黃酮對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖抑制作用
　　不同濃度的金蓮花總黃酮對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞均具有增殖抑制作用。與正常組相比，溶劑組DMSO的最大抑制率不超過(guò)1％，其對(duì)細(xì)胞

5、增殖及活性幾乎無(wú)影響，故后面的實(shí)驗(yàn)不再設(shè)溶劑組。同一時(shí)相，不同濃度藥物對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖抑制率隨藥物濃度的增高而增高，與正常組相比具有顯著性差異(P＜0.05);且不同濃度組之間，對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖抑制率相比具有顯著性(P＜0.05)。不同時(shí)相，相同濃度藥物組對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增高，具有顯著性差異(P＜0.05)。
　　2.金蓮花總黃酮促乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察
　　2.1 微分干涉觀察細(xì)胞

6、形態(tài)
　　正常組MCF-7細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞大小均勻。經(jīng)藥物處理后，細(xì)胞回縮，形態(tài)逐漸變圓，細(xì)胞間連接變松散、稀疏。貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞表面產(chǎn)生了許多泡狀或芽狀突起“膜氣泡”。細(xì)胞核膨大，胞質(zhì)固縮，表現(xiàn)出典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，且隨藥物濃度的增加，凋亡細(xì)胞數(shù)增多，細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變?cè)絹?lái)越明顯。
　　2.2 HE染色結(jié)果
　　正常組MCF-7細(xì)胞呈梭形貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞完整，核質(zhì)染色均勻，核仁明顯，核質(zhì)比例大，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)

7、緊密，可見(jiàn)處于分裂期的細(xì)胞。與正常組相比，0.0991，0.1982，0.3964 mg· mL-1不同濃度藥物作用后，MCF-7細(xì)胞處于分裂期的細(xì)胞消失，細(xì)胞皺縮變形，體積變小，細(xì)胞間隙逐漸增大，連接稀疏。染色質(zhì)濃縮，被染成藍(lán)黑色。而藥物濃度為0.7964，1.5856 mg· mL-1時(shí)，MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞膜連續(xù)性完全被破壞，且貼壁的MCF-7細(xì)胞數(shù)目減少很多，與DIC軟件拍攝細(xì)胞形態(tài)以及掃描電鏡所表達(dá)的隨濃度增大細(xì)胞凋亡數(shù)目增多

8、相一致。
　　2.3 Hoechst染色觀察細(xì)胞形態(tài)
　　正常組MCF-7細(xì)胞，核形態(tài)規(guī)則，大小均一，發(fā)出淡藍(lán)色均勻彌散的熒光。經(jīng)藥物處理后細(xì)胞發(fā)生凋亡，貼壁細(xì)胞數(shù)目減少，核皺縮，呈現(xiàn)致密熒光，濃染比例增加，且細(xì)胞核發(fā)生碎裂，表現(xiàn)為塊狀或點(diǎn)狀藍(lán)色熒光。隨藥物濃度的增加，典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變?cè)絹?lái)越明顯。
　　2.4 掃描電鏡結(jié)果
　　正常組MCF-7細(xì)胞表面的微絨毛豐富且粗壯，細(xì)胞完整，呈葵花狀。胞質(zhì)向四周伸展，與

9、臨近細(xì)胞相連，并緊貼于支持物生長(zhǎng)。與正常組相比，不同藥物組細(xì)胞表面微絨毛萎縮，散在細(xì)胞周圍。細(xì)胞收縮，體積變小，細(xì)胞間連接斷裂。隨藥物濃度的增加，凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸增多，細(xì)胞典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變逐漸明顯，且呈現(xiàn)出不同階段的凋亡特征。在藥物濃度為0.7964，1.5856 mg· mL-1時(shí)，細(xì)胞膜表面凹陷，甚至產(chǎn)生類似空洞的結(jié)構(gòu)。
　　2.5 激光共聚焦（AnnexinⅤ-FITC雙標(biāo)法）觀察結(jié)果
　　正常組MCF-7細(xì)胞不被A

10、nnexinⅤ或PI染色。與正常組相比，不同濃度藥物組均可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，其中，藥物組早期凋亡MCF-7細(xì)胞的PS蛋白外翻到細(xì)胞膜表面，AnnexinⅤ高染呈綠色熒光。藥物組中晚期凋亡MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞膜被破壞，PI進(jìn)入細(xì)胞標(biāo)記細(xì)胞核，開(kāi)始出現(xiàn)紅色熒光，AnnexinⅤ和PI均高染，呈現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)?？傊?，藥物作用后細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，呈現(xiàn)出典型的細(xì)胞凋亡特征。
　　3.金蓮花總黃酮誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡

11、作用
　　Western結(jié)果表明，與正常組相比，隨藥物濃度增加，MCF-7細(xì)胞內(nèi)FasL和p53蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯變化，說(shuō)明金蓮花總黃酮對(duì)FasL和p53蛋白的表達(dá)無(wú)影響;而金蓮花總黃酮能夠下調(diào)MCF-7細(xì)胞中NF-κB和Bcl-2蛋白的表達(dá)，能夠提高M(jìn)CF-7細(xì)胞中caspase-3和caspase-9的蛋白水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　1.金蓮花總黃酮能夠抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
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