HPV16 E7癌基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HaCaT細胞系的建立及其對HLA-Ⅰ類分子表達的影響.pdf

1、目的: 通過真核表達載體pCMV-tag2B將HPVl6 E7基因?qū)肴擞郎砥ぜ毎鸋aCaT，建立穩(wěn)定表達HPVl6E7的HaCaT-E7細胞系，探討HPVl6E7癌基因?qū)LA-I類分子表達的影響及相關機制。 方法: 1.穩(wěn)定表達HPVl6 E7 HaCaT細胞系的建立取對數(shù)生長期的HaCaT細胞，分別轉(zhuǎn)染pCMV-E7、pCMV-tag2B質(zhì)粒及設立空白對照組。500ug/ml G418篩選21天后，空白

2、對照組的正常細胞全部死亡，轉(zhuǎn)染組挑選陽性克隆，擴大培養(yǎng)，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HPVl6 E7的細胞系HaCaT-E7及空載體對照細胞系HaCaT-pCMV。 2.HaCaT-E7細胞系的鑒定取對數(shù)生長期正常HaCaT細胞、HaCaT-E7細胞、HaCaT-pCMV細胞，TRIZOL法提取細胞總RNA，以OligdT引物將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以管家基因β-actin為內(nèi)參照，實時熒光定量PCR檢測HPVl6E7 mRNA的表達；分別提

3、取正常HaCaT細胞、HaCaT-E7細胞、HaCaT-pCMV細胞總蛋白，經(jīng)SDS-聚丙稀酰胺(SDS-PAGE)蛋白電泳，Western Blot檢測HPVl6E7蛋白的表達。 3.流式細胞術檢測細胞膜表面HLA-I類分子的表達取對數(shù)生長期正常HaCaT細胞、HaCaT-E7細胞、HaCaT-pCMV細胞，0.25％胰酶消化，含1％牛血清白蛋白的PBS(BSA，PBS-B)調(diào)整細胞濃度為107cells/ml。取100μ1細

4、胞懸液，加入20ul抗HLA-ABC-FITC或抗KLH-FITC(同型對照)，混勻后避光靜置20min，PBS-B沖洗兩遍，400μlPBS-B重懸，上機檢測。同理用抗CD46-FITC檢測細胞膜表面CD46，做為陽性對照。 4.兩步法實時熒光定量PCR檢測HLA-ImRNA的表達取對數(shù)生長期正常HaCaT細胞、HaCaT-E7細胞、HaCaT-pCMV細胞，TRIZOL法提取細胞總RNA，以OligdT引物將RNA逆轉(zhuǎn)錄為c

5、DNA。以管家基因β-actin為內(nèi)參照，實時熒光定量PCR檢測HLA-A、 HLA-B、HLA-C mRNA的表達。反應結(jié)束得到各個基因的循環(huán)閾值(Ct值)，用相對定量的方法(2一△△cT)來分析各個基因mRNA表達的改變。 結(jié)果: 1.轉(zhuǎn)染HPVl6 E7后，500ug/ml G418篩選21天，出現(xiàn)單細胞克隆。實時熒光定量PCR檢測HaCaT-E7組細胞HPVl6 E7 mRNA的表達，HPVl6 E7與內(nèi)參照β-

6、actin相差約13.27±0.86個循環(huán)。擴增產(chǎn)物進行2％瓊脂糖凝膠電泳，擴增片段約93bp，與HPVl6 E7目的片段相符。Western Blot結(jié)果顯示，HaCaT-E7組細胞在17KD處檢測到HPVl6 E7蛋白的表達，與Caski細胞系所表達的HPVl6E7位置一致，證實HPVl6 E7蛋白在HaCaT-E7細胞中穩(wěn)定表達，HaCaT-E7細胞系構建成功。 2.流式細胞術檢測正常HaCaT組、HaCaT-pCMV組、

7、HaCaT-E7組細胞表面HLA-ABC：三組細胞平均熒光強度依次為357.65±15.65、346.82±16.77、182.16±16.47。HaCaT-E7組比正常HaCaT組和HaCaT-pCMV組HLA-ABC的表達顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義。CD46分子表達于人類所有細胞膜表面，其在三組細胞中的表達差異沒有統(tǒng)計學意義，表明HPVl6 E7癌基因的導入對其它膜表面分子的表達沒有影響，HaCaT-E7組細胞HLA-ABC的下降是

8、特異性的。 3.實時熒光定量PCR檢測正常HaCaT組、HaCaT-pCMV組、HaCaT-E7組細胞HLA-A、B、C mRNA的表達： 2-ΔΔcT法計算出各個基因針對內(nèi)參照β-actin的相對表達量，A、B、C三個位點在HaCaT-E7組的表達與正常HaCaT組及HaCaT-pCMV組相比，差異均無統(tǒng)計學意義(HLA-A，P=0.954；HLA-B，P=0.78l；HLA-C.P=0.821)。 結(jié)論: 1