hIFN-λ穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立及其體外抗HBV機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性公共健康問題，迄今尚無根治藥物。目前常用的抗病毒治療藥物如核苷（酸）類似物、干擾素不能徹底清除病毒、費用高、部分病人療效欠佳、副作用大、容易產(chǎn)生耐藥性，因此研發(fā)新的抗HBV藥物仍是醫(yī)學(xué)界亟待解決的難題。
　　研究發(fā)現(xiàn)IFN-λ對HBV和HCV均有抑制作用，且IFN-λ已用于臨床治療丙型病毒性肝炎。相較于IFN-α，IFN-λ受體在血液系統(tǒng)和神經(jīng)體統(tǒng)分布明顯少于IFN-α，有望用于

2、臨床上對IFN-α無應(yīng)答或副作用大的患者。本研究擬建立可以表達(dá)人IFN-λ的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，并對其培養(yǎng)上清中IFN-λ生物學(xué)活性進(jìn)行分析，進(jìn)而研究IFN-λ在體外對HBV的作用及其分子機(jī)制，為IFN-λ用于臨床治療慢性乙型肝炎提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.用polyI:C刺激人PBMC，使其IFN-λ表達(dá)上調(diào)。設(shè)計特異性引物用RT-PCR技術(shù)從PBMC中擴(kuò)增IFN-λ基因（IFN-λ1、2、3）編碼區(qū)mRNA全長后將其

3、克隆入克隆載體pMD18-T Vector進(jìn)一步擴(kuò)增。
　　2.將pMD18-T-IFN-λ和表達(dá)載體pIRES2-EGFP用salⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切后連接，構(gòu)建雙順反子表達(dá)載體pIRES2-EGFP-IFN-λ。
　　3.使用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將表達(dá)載體pIRES2-EGFP-IFN-λ轉(zhuǎn)染入BHK細(xì)胞，G418篩選建立穩(wěn)定真核表達(dá)細(xì)胞系，使其能持續(xù)表達(dá)IFN-λ，并檢測其表達(dá)IFN-λ濃度。<

4、br>　　4.檢測穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系BHK-IFN-λ分泌IFN-λ的抗病毒活性、抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性及誘導(dǎo)抗病毒蛋白作用。
　　5.流式細(xì)胞術(shù)檢測干擾素λ干預(yù)HepG2215細(xì)胞1h、4h、12h、24h、48h、72h后對細(xì)胞內(nèi)STAT1/STAT2磷酸化水平的影響。
　　6.ELISA檢測干擾素λ干預(yù)HepG2215細(xì)胞1h、4h、12h、24h、48h、72h后其HBV-DNA、HBsAg、HBeAg分泌水平的差異。

5、r>　　7.RT-PCR檢測干擾素λ干預(yù)HepG2215細(xì)胞1h、4h、12h、24h、48h、72h后其PD-L1、IRF3、IRF7、IRF9、ISG15、APOBEC3G、USP18、MXA基因表達(dá)情況差異。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建表達(dá)載體pIRES2-EGFP-IFN-λ，經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定及測序，所得結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致。
　　2.成功建立能表達(dá)高濃度IFN-λ的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，經(jīng)過檢測，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系培

6、養(yǎng)上清具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抗病毒感染、誘導(dǎo)抗病毒蛋白產(chǎn)生的生物學(xué)活性。
　　3.IFN-λ有抑制HBV-DNA復(fù)制和HBsAg、HBeAg分泌的作用，且其作用時間長于IFN-α。
　　4.IFN-λ與IFN-α均有促進(jìn)JAK-STAT通路中STAT1/STAT2磷酸化作用，而前者磷酸化時間長于后者。
　　5.含HBV基因的HepG2215細(xì)胞與肝癌細(xì)胞系HepG2相比，USP18、IRF3、PD-L1、APOBEC3

7、G基因基礎(chǔ)表達(dá)明顯上調(diào)，MxA、IRF7、IRF9基因基礎(chǔ)表達(dá)部分刺激時間段內(nèi)上調(diào)。而ISG15基因基礎(chǔ)表達(dá)則下調(diào)。
　　6.含HBV基因的HepG2215細(xì)胞分別用IFN-λ和IFN-α刺激后，除PD-L1外各基因出現(xiàn)不同程度的表達(dá)上調(diào)。IFN-λ干預(yù)后各基因的表達(dá)上調(diào)較IFN-α延后，在后期部分基因（IRF3、IRF9、ISG15、USP18、MxA、APOBEC3G）表達(dá)上調(diào)甚至超過IFN-α干預(yù)后。而PD-L1則未見明顯上

8、調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建表達(dá)載體pIRES2-EGFP-IFN-λ，并建立持續(xù)表達(dá)高濃度IFN-λ的穩(wěn)定真核表達(dá)細(xì)胞系，其表達(dá)的IFN-λ具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抗病毒感染、誘導(dǎo)抗病毒蛋白產(chǎn)生等生物學(xué)活性。
　　2.IFN-λ能有效抑制HBV-DNA復(fù)制和HBsAg、HBeAg分泌。
　　3.IFN-λ抗HBV作用時間較IFN-α有延后效應(yīng)，這與既往研究結(jié)果是一致的，這可能與前者磷酸化時間延后有關(guān)，表明I

9、FN-λ有效抑制HBV-DNA的時間可能更長。
　　4.HepG2215細(xì)胞除ISG15外各基因基礎(chǔ)表達(dá)較HepG2上調(diào)，這可能與其處于自身免疫激活狀態(tài)有關(guān)。而IFN-λ的干預(yù)后，加大了這種狀態(tài)，可能更利于病毒的清除。
　　5.與IFN-α相比，IFN-λ干預(yù)后HepG2215細(xì)胞PD-L1基因未見明顯升高，這可能促進(jìn)了IFN-λ抗HBV作用。
　　6.HepG2215較HepG2細(xì)胞ISG15基因基礎(chǔ)表達(dá)是下調(diào)的，而

10、IFN干預(yù)后則明顯上調(diào)，且IFN-λ干預(yù)后其上調(diào)明顯高于IFN-α，這可能是兩種干擾素抗HBV存在差異性的原因之一，也可能是后者較前者抗HBV作用的優(yōu)勢所在。
　　創(chuàng)新點與不足：
　　1.成功建立具有生物學(xué)活性的IFN-λ穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。
　　2.通過檢測兩種IFN干預(yù)后HepG2215細(xì)胞HBV-DNA、HBsAg、HBeAg分泌，關(guān)鍵信號分子STAT1/STAT2磷酸化水平，相關(guān)基因表達(dá)等方面揭示IFN-λ體外抗H