hIFN-λ穩(wěn)定轉染細胞系的建立及其體外抗HBV機制研究.pdf

1、目的：
　　乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性公共健康問題，迄今尚無根治藥物。目前常用的抗病毒治療藥物如核苷（酸）類似物、干擾素不能徹底清除病毒、費用高、部分病人療效欠佳、副作用大、容易產(chǎn)生耐藥性，因此研發(fā)新的抗HBV藥物仍是醫(yī)學界亟待解決的難題。
　　研究發(fā)現(xiàn)IFN-λ對HBV和HCV均有抑制作用，且IFN-λ已用于臨床治療丙型病毒性肝炎。相較于IFN-α，IFN-λ受體在血液系統(tǒng)和神經(jīng)體統(tǒng)分布明顯少于IFN-α，有望用于

2、臨床上對IFN-α無應答或副作用大的患者。本研究擬建立可以表達人IFN-λ的穩(wěn)定轉染細胞系，并對其培養(yǎng)上清中IFN-λ生物學活性進行分析，進而研究IFN-λ在體外對HBV的作用及其分子機制，為IFN-λ用于臨床治療慢性乙型肝炎提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.用polyI:C刺激人PBMC，使其IFN-λ表達上調。設計特異性引物用RT-PCR技術從PBMC中擴增IFN-λ基因（IFN-λ1、2、3）編碼區(qū)mRNA全長后將其

3、克隆入克隆載體pMD18-T Vector進一步擴增。
　　2.將pMD18-T-IFN-λ和表達載體pIRES2-EGFP用salⅠ和BamHⅠ進行雙酶切后連接，構建雙順反子表達載體pIRES2-EGFP-IFN-λ。
　　3.使用脂質體Lipofectamine2000將表達載體pIRES2-EGFP-IFN-λ轉染入BHK細胞，G418篩選建立穩(wěn)定真核表達細胞系，使其能持續(xù)表達IFN-λ，并檢測其表達IFN-λ濃度。<

4、br>　　4.檢測穩(wěn)定表達細胞系BHK-IFN-λ分泌IFN-λ的抗病毒活性、抑制腫瘤細胞增殖活性及誘導抗病毒蛋白作用。
　　5.流式細胞術檢測干擾素λ干預HepG2215細胞1h、4h、12h、24h、48h、72h后對細胞內STAT1/STAT2磷酸化水平的影響。
　　6.ELISA檢測干擾素λ干預HepG2215細胞1h、4h、12h、24h、48h、72h后其HBV-DNA、HBsAg、HBeAg分泌水平的差異。

5、r>　　7.RT-PCR檢測干擾素λ干預HepG2215細胞1h、4h、12h、24h、48h、72h后其PD-L1、IRF3、IRF7、IRF9、ISG15、APOBEC3G、USP18、MXA基因表達情況差異。
　　結果：
　　1.成功構建表達載體pIRES2-EGFP-IFN-λ，經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定及測序，所得結果與預期結果一致。
　　2.成功建立能表達高濃度IFN-λ的穩(wěn)定表達細胞系，經(jīng)過檢測，穩(wěn)轉細胞系培

6、養(yǎng)上清具有抑制腫瘤細胞增殖、抗病毒感染、誘導抗病毒蛋白產(chǎn)生的生物學活性。
　　3.IFN-λ有抑制HBV-DNA復制和HBsAg、HBeAg分泌的作用，且其作用時間長于IFN-α。
　　4.IFN-λ與IFN-α均有促進JAK-STAT通路中STAT1/STAT2磷酸化作用，而前者磷酸化時間長于后者。
　　5.含HBV基因的HepG2215細胞與肝癌細胞系HepG2相比，USP18、IRF3、PD-L1、APOBEC3

7、G基因基礎表達明顯上調，MxA、IRF7、IRF9基因基礎表達部分刺激時間段內上調。而ISG15基因基礎表達則下調。
　　6.含HBV基因的HepG2215細胞分別用IFN-λ和IFN-α刺激后，除PD-L1外各基因出現(xiàn)不同程度的表達上調。IFN-λ干預后各基因的表達上調較IFN-α延后，在后期部分基因（IRF3、IRF9、ISG15、USP18、MxA、APOBEC3G）表達上調甚至超過IFN-α干預后。而PD-L1則未見明顯上

8、調。
　　結論：
　　1.成功構建表達載體pIRES2-EGFP-IFN-λ，并建立持續(xù)表達高濃度IFN-λ的穩(wěn)定真核表達細胞系，其表達的IFN-λ具有抑制腫瘤細胞增殖、抗病毒感染、誘導抗病毒蛋白產(chǎn)生等生物學活性。
　　2.IFN-λ能有效抑制HBV-DNA復制和HBsAg、HBeAg分泌。
　　3.IFN-λ抗HBV作用時間較IFN-α有延后效應，這與既往研究結果是一致的，這可能與前者磷酸化時間延后有關，表明I

9、FN-λ有效抑制HBV-DNA的時間可能更長。
　　4.HepG2215細胞除ISG15外各基因基礎表達較HepG2上調，這可能與其處于自身免疫激活狀態(tài)有關。而IFN-λ的干預后，加大了這種狀態(tài)，可能更利于病毒的清除。
　　5.與IFN-α相比，IFN-λ干預后HepG2215細胞PD-L1基因未見明顯升高，這可能促進了IFN-λ抗HBV作用。
　　6.HepG2215較HepG2細胞ISG15基因基礎表達是下調的，而

10、IFN干預后則明顯上調，且IFN-λ干預后其上調明顯高于IFN-α，這可能是兩種干擾素抗HBV存在差異性的原因之一，也可能是后者較前者抗HBV作用的優(yōu)勢所在。
　　創(chuàng)新點與不足：
　　1.成功建立具有生物學活性的IFN-λ穩(wěn)定表達細胞系。
　　2.通過檢測兩種IFN干預后HepG2215細胞HBV-DNA、HBsAg、HBeAg分泌，關鍵信號分子STAT1/STAT2磷酸化水平，相關基因表達等方面揭示IFN-λ體外抗H