香附揮發(fā)油誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:通過(guò)超臨界CO2萃取法制取香附揮發(fā)油(以下簡(jiǎn)稱ACA)，研究ACA體外誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡作用及其機(jī)制。
　　方法:(1)采用超臨界CO2裝置萃取ACA;(2)采用MTT比色法和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性測(cè)定確定ACA抗肺癌A549細(xì)胞的量-效和時(shí)-效關(guān)系;(3)采用離體肺組織切片，判斷ACA毒性大小;(4)Hoechst33342/PI及AnnexinⅤ-EGFP/PI雙重

2、熒光染色觀察A549細(xì)胞死亡情況;(5)Fura-2AM法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度;(6)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，證明ACA致細(xì)胞氧化損傷作用;(7)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ATP含量，證明ACA對(duì)細(xì)胞能量代謝的影響;(8)羅丹明123(Rh123)檢測(cè)線粒體膜電位(△ψ);(9)Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax表達(dá)水平，分光光度計(jì)法測(cè)

3、定半胱天冬酶-9(caspase-9)表達(dá)量。
　　結(jié)果:(1)ACA對(duì)A549細(xì)胞活力影響呈明顯濃度、時(shí)間依賴關(guān)系。ACA286μg/mL作用24h或200μg/mL作用48h，幾乎100％殺死癌細(xì)胞，效能(efficacy)高于陽(yáng)性對(duì)照藥順鉑(cisplatin，DDP)，說(shuō)明ACA誘導(dǎo)A549凋亡作用效能強(qiáng)大、起效迅速。(2)ACA致A549細(xì)胞膜損傷，促胞內(nèi)LDH釋放增多;(3)ACA對(duì)正常肺組織的毒性在一個(gè)可接受范圍內(nèi);

4、(4)Hoechst33342/PI和AnnexinⅤ-EGFP/PI雙重?zé)晒馊旧^察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，證明ACA誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡;(5)ACA導(dǎo)致細(xì)胞鈣超載;(6)ACA顯著提高細(xì)胞內(nèi)MDA水平，抑制SOD活性，致細(xì)胞氧化損傷;(7)ACA抑制細(xì)胞能量代謝;(8)ACA致線粒體結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損和功能喪失，膜電位喪失;(9)ACA促Bax/Bcl-2比值升高，caspase-9活性增加。
　　結(jié)論:ACA通過(guò)誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧化應(yīng)