香煙煙霧提取物誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞相關(guān)分子改變的比較蛋白組學(xué)研究.pdf

1、研究目的：吸煙是公認(rèn)的肺癌發(fā)生重要危險(xiǎn)因素，對(duì)肺癌的影響不僅儀限于引起肺癌的發(fā)生，而且對(duì)肺癌的預(yù)后及治療效果也有著十分重要的影響，特別在肺腺癌患者中，如患者繼續(xù)吸煙其存活率較成煙或不吸煙者更差，然而其分子機(jī)制尚不清楚。香煙煙霧中有害物質(zhì)不但可作用支氣管肺上皮細(xì)胞誘導(dǎo)其癌變，而且還能通過(guò)繼續(xù)刺激肺癌細(xì)胞，造成肺癌細(xì)胞中基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)發(fā)生改變，這些基因表達(dá)的變化勢(shì)必影響肺癌細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的改變，從而進(jìn)一步影響肺癌細(xì)胞的生物學(xué)特性。已有的研究

2、多集中在香煙煙霧造成肺癌患者單一或少數(shù)幾個(gè)基因表達(dá)的差異上，近幾年蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)繼續(xù)的發(fā)展為探索香煙煙霧中有害物質(zhì)誘導(dǎo)肺癌進(jìn)展的分子機(jī)制提供了很好的技術(shù)平臺(tái)，目前香煙煙霧中有害物質(zhì)誘導(dǎo)肺癌進(jìn)展的蛋白組學(xué)變化的研究甚少。本研究通過(guò)香煙煙霧提取物及其主要的致癌物苯并芘模擬吸煙體外處理人肺腺癌A549細(xì)胞，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究香煙煙霧及其致癌物苯并芘誘導(dǎo)肺癌患者進(jìn)展的分子機(jī)制。
　　 第一章苯并芘誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞相關(guān)分子改變

3、的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 研究方法：
　　 使用0.1μM、1μM、10μM苯并(a)芘(Benzo(a)Pyrene，B(a)P)處理A549細(xì)胞72h，檢測(cè)各組細(xì)胞中的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平及脂質(zhì)過(guò)氧化(lipid peroxidation，LPO)水平。應(yīng)用二維凝膠電泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)分離B(a)P處理組(B

4、(a)P-A549)、對(duì)照組(DMSO-A549)的總蛋白質(zhì)，圖像分析識(shí)別差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)鑒定差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，Western blot驗(yàn)證差異蛋白heat shock protein27(HSP27)以及Mn superoxide dismutase(Mn SOD)的表達(dá)。使用0.1μM、1μM、10μM B(a)P處理A549細(xì)胞后，應(yīng)用Western blot及RT-PC

5、R檢測(cè)各組細(xì)胞中MnSOD的表達(dá)，檢測(cè)各組細(xì)胞中總抗氧化活性(total antioxidant capacity)、總SOD活性(totalactivity of SOD)、過(guò)氧化氫酶活性(catalase activity，CAT)、谷胱甘肽還原酶活性(glutathione reductase，Gr)。
　　 研究結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)1μM B(a)P可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞中活性氧水平增高并導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化。采用一步抽提法制備B(a

6、)P-A549及DMSO-A549細(xì)胞株的總蛋白質(zhì)，應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)建立了重復(fù)性和分辨率均較好的的雙向凝膠電泳圖譜。PDQuest軟件對(duì)兩株細(xì)胞蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜進(jìn)行了比較，識(shí)別了39個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。采用MALDI-TOF-MS對(duì)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，獲取MALDI-TOF-MS肽質(zhì)量指紋圖譜，數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定了23個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。Western blot證實(shí)HSP27及Mn SOD的表達(dá)水平在B(a)P處理組中較對(duì)照

7、組明顯下調(diào)，其結(jié)果與比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究的結(jié)果一致；使用0.1μM、1μM、10μMB(a)P處理A549細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)隨著B(niǎo)(a)P的濃度升高，雖然Mn SOD的表達(dá)及SOD活性出現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制的現(xiàn)象，但CAT及Gr活性的增高依然提高了機(jī)體的總抗氧化活性。
　　 研究結(jié)論：采用蛋白組學(xué)技術(shù)分析了香煙煙霧中的致癌物B(a)P對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響，質(zhì)譜鑒定了23個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中HSP27及Mn SOD有望成為監(jiān)測(cè)香

8、煙煙霧中B(a)P氧化應(yīng)激損傷的生物分子標(biāo)志物；隨著B(niǎo)(a)P的濃度升高，Mn SOD的表達(dá)及SOD活性出現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制，而CAT及Gr的活性增高提高了機(jī)體的總抗氧化活性，CAT及Gr在對(duì)抗B(a)P帶來(lái)的氧化損傷方面可能具有十分重要的作用。
　　 第二章香煙煙霧提取物誘導(dǎo)A549細(xì)胞相關(guān)分子改變的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 研究方法：通過(guò)香煙煙霧提取物長(zhǎng)期處理A549細(xì)胞(16周)以模擬肺癌患者繼續(xù)吸煙的狀態(tài)(Curre

9、nt-smoking組)，處理16周后換用不含香煙煙霧提取物的普通培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8周以模擬肺癌后戒煙的狀態(tài)(Ex-smoking組)，同時(shí)使用一直用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的A549細(xì)胞以模擬不吸煙肺癌患者的狀態(tài)(Non-smoking組)作為對(duì)照組。提取上述三組細(xì)胞的總蛋白，采用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)分離鑒定差異蛋白質(zhì)，應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力的變化；應(yīng)用Western blot及RT-PCR驗(yàn)證部分

10、差異蛋白的表達(dá)。
　　 研究結(jié)果：本研究應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)建立了重復(fù)性和分辨率均較好的Current-smoking組、Ex-smoking組及其對(duì)照組Non-smoking組細(xì)胞的雙向凝膠電泳圖譜；PDQuest軟件對(duì)三株細(xì)胞蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)有19種差異蛋白的表達(dá)在去除CSE后8周(Ex-smoking組)中恢復(fù)到了對(duì)照組(Non-smoking組)的水平，而剩余的21種蛋白的表達(dá)在去除CSE后8周(Ex

11、-smoking組)中并沒(méi)有恢復(fù)到對(duì)照組(Non-smoking組)的水平。劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CSE處理后的A549細(xì)胞(Current-smoking組)侵袋及遷移能力明顯比對(duì)照組A549細(xì)胞增高，且經(jīng)過(guò)脫毒處理8周的Ex-smoking組仍然高于對(duì)照組，這說(shuō)明決定侵袋轉(zhuǎn)移能力增高的差異蛋白在脫毒處理后應(yīng)該沒(méi)有回復(fù)到對(duì)照組的水平。通過(guò)生物信息學(xué)分析后，本研究選擇Nm23-H1、14-3-3σ及vimentin這三種與

12、腫瘤遷移相關(guān)的差異蛋白繼續(xù)研究。Western blot及RT-PCR證實(shí)CSE作用A549細(xì)胞16周后及脫毒處理8周后，vimentin的表達(dá)水平明顯增高，而nm23-H1及14-3-3σ表達(dá)水平明顯下降。
　　 研究結(jié)論：本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選到40個(gè)香煙煙霧誘導(dǎo)A549細(xì)胞差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，這些差異表達(dá)蛋白可能與香煙煙霧誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)。其中Nm23-H1及14-3-3σ表達(dá)下降，vimentin表達(dá)上升可

13、能與香煙煙霧誘導(dǎo)A549細(xì)胞侵襲及遷移能力明顯增高有關(guān)。
　　 第三章部分差異蛋白與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系
　　 研究方法：采用免疫組化染色檢測(cè)部分差異蛋白質(zhì)vimentin、nm23-H1及14-3-3σ在74例肺鱗癌及51例肺腺癌組織中的表達(dá)，并分析vimentin、nm23-H1及14-3-3σ表達(dá)水平與臨床病理特征和患者預(yù)后的關(guān)系。
　　 研究結(jié)果：實(shí)驗(yàn)顯示患者吸煙嚴(yán)重程度與vimentin

14、表達(dá)正相關(guān)，與nm23-H1及14-3-3σ的表達(dá)負(fù)相關(guān)。vimemin表達(dá)與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況呈正相關(guān)，14-3-3σ表達(dá)與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況呈負(fù)相關(guān)，nm23-H1表達(dá)與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況呈負(fù)相關(guān)。Nm23-H1及14-3-3σ表達(dá)下調(diào)、vimentin表達(dá)上調(diào)的肺癌患者，生存率明顯下降。
　　 研究結(jié)論：Vimentin、nm23-H1及14-3-3σ與肺癌的吸煙程度、轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)，有望成為預(yù)測(cè)吸煙的非小細(xì)胞肺癌患者轉(zhuǎn)移

15、及預(yù)后的分子標(biāo)志物及潛在的治療靶標(biāo)。
　　 總結(jié)：
　　 1)采用蛋白組學(xué)技術(shù)分析了香煙煙霧中的致癌物B(a)P對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響，質(zhì)潛鑒定了23個(gè)差異表達(dá)蛋白，HSP27及Mn SOD有望成為監(jiān)測(cè)香煙煙霧中B(a)P氧化應(yīng)激損傷的生物分子標(biāo)志物。
　　 2)隨著B(niǎo)(a)P的濃度升高，Mn SOD的表達(dá)及SOD活性出現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制，而CAT及Gr的活性增高提高了機(jī)體的總抗氧化活性，CAT及Gr在

16、對(duì)抗B(a)P帶來(lái)的氧化損傷方面可能具有十分重要的作用。
　　 3)采用蛋白組學(xué)技術(shù)分析了香煙煙霧提取物長(zhǎng)期處理及脫毒處理后A549細(xì)胞蛋白表達(dá)的變化，鑒定了40種差異表達(dá)蛋白，這些差異表達(dá)蛋白可能與香煙煙霧誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)。其中Nm23-H1及14-3-3σ表達(dá)下降，vimentin表達(dá)上升可能與香煙煙霧誘導(dǎo)A549細(xì)胞侵襲及遷移能力明顯增高有關(guān)。
　　 4)Vimentin、nm23-H1及14-3-3σ與