骨髓間充質(zhì)干細胞聯(lián)合富血小板血漿促進糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面愈合的實驗研究.pdf

1、背景:糖尿病傷口愈合是一個重要的臨床挑戰(zhàn)，因為輕微的皮膚傷口可能會導(dǎo)致慢性的，未愈合的潰瘍，最終導(dǎo)致感染，壞疽，甚至截肢。隨著干細胞治療研究的發(fā)展，骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)在治療糖尿病皮膚潰瘍的研究中表現(xiàn)出巨大的潛能。另有研究表明，富含血小板血漿(PRP)含有一系列生長因子，為創(chuàng)面的愈合和修復(fù)提供良好微環(huán)境，從而促進組織創(chuàng)傷愈合和再生。因此，探討兩者聯(lián)用于糖尿病傷口愈合顯得尤為重要，能夠為將來的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
　　

2、 第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞系的建立和鑒定
　　 目的:體外分離BMSCs，并對分離的細胞進行生物學(xué)鑒定，從而建立穩(wěn)定的BMSCs培養(yǎng)擴增體系。
　　 方法:
　　 1.采用貼壁培養(yǎng)法分離幼年SD大鼠骨髓中的BMSCs，然后進行純化和擴增細胞。
　　 2.通過對細胞形態(tài)學(xué)觀察、流式細胞儀檢測BMSCs特異的表面抗原和細胞周期的測定等，從而確立穩(wěn)定的BMSCs培養(yǎng)擴增體系。
　　 結(jié)果:
　

3、　 1.原代細胞在3-5天內(nèi)呈相對靜止狀態(tài)，隨后生長迅速。第二代細胞形態(tài)均一，呈扁平狀、梭形。
　　 2.在分離的BMSCs中，CD90和CD29陽性率＞90％，而CD45和CD11b/C陽性率＜2％。
　　 3.85.33％的第二代BMSCs細胞處于G0/G1期，而處S期和G2期的細胞分別為4.76％和9.91％。
　　 結(jié)論:分離得到的細胞形態(tài)均一，且大部分細胞處于靜止期，細胞增殖速度較緩慢，更重要的是能夠

4、特異表達BMSCs相關(guān)的標記分子。即表明已成功分離到大鼠的BMSCs，為后續(xù)的實驗研究打下堅實的基礎(chǔ)，從而保證了實驗數(shù)據(jù)的重復(fù)性和可靠性。
　　 第二部分富血小板血漿制備及對骨髓間充質(zhì)干細胞的作用
　　 目的:制備PRP并考察其對BMSCs的生物學(xué)影響，評估PRP的生物學(xué)作用。
　　 方法:
　　 1.收集健康志愿者靜脈血，采用二次離心法制備PRP。
　　 2.分別用含有0，1％，2.5％，5％的

5、PRP無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)BMSCs，通過MTT法和檢測細胞周期，考察PRP對細胞的增殖影響。
　　 結(jié)果:MTT結(jié)果顯示，1％、2.5％和5％PRP對細胞的增殖都有促進作用，且隨時間的延長呈劑量相關(guān)性。細胞周期結(jié)果顯示，5％PRP組S期細胞百分比明顯高于空白組，表明PRP可促進細胞DNA復(fù)制。
　　 結(jié)論:PRP可促進BMScs增殖，使得兩者聯(lián)用于創(chuàng)面愈合實驗成為可能，因此為下一步動物創(chuàng)面愈合實驗打下堅實的基礎(chǔ)。
　

6、　 第三部分骨髓間充質(zhì)干細胞聯(lián)合富血小板血漿對糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面愈合的作用
　　 目的:比較單獨使用BMSCs和PRP及兩者聯(lián)合使用治療糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面的療效，并初步探討B(tài)MSCs和PRP用于組織創(chuàng)傷的可行性和安全性。
　　 方法:
　　 1.SD大鼠單次腹腔注射鏈脈佐菌素(STZ)，劑量為60mg/kg。對照組注射等量的檸檬酸鈉緩沖液。觀察造模組大鼠三多一少癥狀。采取尾靜脈血樣測定血糖水平，血糖水平＞300

7、 mg/d(16.7 mmol/L)視為糖尿病大鼠，繼續(xù)飼養(yǎng)4周，備用。
　　 2.取48只糖尿病大鼠，隨機分成BMSCs聯(lián)合PRP治療組、BMSCs治療組、PRP治療組和對照組四組。在每只大鼠的背部左、右兩側(cè)制作出2×2 cm的創(chuàng)面。
　　 3.術(shù)后每天觀察四組創(chuàng)面愈合情況，用數(shù)碼照相機記錄，測定創(chuàng)面面積，計算愈合率。
　　 4.收集不同時間點的皮膚樣本，進行HE和Masson染色，考察組織愈合情況和膠原纖維合

8、成情況。
　　 5.收集不同時間點的皮膚樣本，進行免疫組化染色，觀察皮膚組織中PCNA、PECAM-1、TGF-β1、CD68陽性細胞的表達數(shù)。Western blot檢測PCNA和CD68的表達情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功建立糖尿病創(chuàng)傷模型，糖尿病SD大鼠均表現(xiàn)出三多一少糖尿病癥狀，血糖水平＞300 mg/d(16.7 mmol/L)。
　　 2.在術(shù)后3，7，10，14，17和21天，比較各組

9、大鼠創(chuàng)面愈合率，各實驗組與對照組相比，均能促進大鼠創(chuàng)面愈合，但BMSCs聯(lián)合PRP治療組創(chuàng)面愈合最快。且在術(shù)后的第21天，BMSCs聯(lián)合PRP治療組愈合率達到96.1％，視為完全愈合。
　　 3.在術(shù)后第14天，BMSCs和PRP治療組可觀察到皮脂腺等皮膚附屬器官，表明皮膚逐漸再生和成熟;且BMSCs聯(lián)和PRP治療組的膠原蛋白表達明顯高于其它組，且膠原纖維束排列整齊。
　　 4.BMSCs聯(lián)合PRP治療組在各個相應(yīng)時間點

10、上，皮膚組織中的PECAM-1、PCNA和TGF-β1表達均高于其他組。在術(shù)后第7天，各實驗組的CD68的表達明顯高于對照組，而在第14天，其表達明顯低于對照組。
　　 結(jié)論:單獨使用BMSCs或PRP及聯(lián)合使用均能促進糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)傷的愈合，但兩者聯(lián)用效果最佳，其分子分子可能是通過提高膠原蛋白合成，刺激新生血管生成，促進細胞的增殖，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)TGF-β1的表達而發(fā)揮促愈合的作用。因此，本研究為將來BMSCs和PRP聯(lián)