miR-29a對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖與凋亡的影響.pdf

1、微小RNAs(miRNAs)是一類大小約21～23個堿基的單鏈小分子RNA,在進化中高度保守,其表達既具有時空特異性,也具有組織和細胞特異性。miRNAs通過與mRNA的3'端UTR序列互補而抑制其翻譯,從而廣泛地參與細胞生物學(xué)過程,包括發(fā)育、細胞增殖、分化、凋亡及代謝等。本實驗室通過miRNA芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向神經(jīng)細胞分化后,miRNAs的

2、表達譜發(fā)生明顯改變,其中miR-29a的表達量較分化前增高最為明顯。已有研究表明,miR-29a在胚胎期組織中不表達或低表達,但在生物體成熟組織細胞中廣泛表達,也有研究發(fā)現(xiàn)miR-29a在肉瘤、胃癌、白血病等癌癥中表達降低,提示miR-29a可抑制腫瘤細胞的增殖,促進凋亡。因此,我們推測miR-29a可能影響B(tài)MSCs的增殖分化過程并參與BMSCs的增殖分化調(diào)控。
　　 間充質(zhì)干細胞是來源于中胚層的成體干細胞,廣泛存在于全身結(jié)締

3、組織和器官間質(zhì)中,以骨髓組織中含量最為豐富。BMSCs具有高度增殖、自我更新和多向分化潛能。BMSCs在特定的誘導(dǎo)條件下能分化為特定的成體細胞,同時喪失增殖能力和多向分化潛能,被認為是臨床細胞替代治療的理想細胞來源。但是,對BMSCs增殖特性的維持和分化調(diào)控機制尚不清楚。
　　 本實驗為了研究miR-29a對骨髓間充質(zhì)干細胞生物學(xué)特性的影響,用慢病毒介導(dǎo)miR-29a前體表達載體感染骨髓間充質(zhì)干細胞,采用流式細胞儀測定miR-2

4、9a過表達和抑制時骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖與凋亡的變化,生物信息學(xué)分析miR-29a對骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖和凋亡的調(diào)控靶位點和機制,進一步探討miR-29a對骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖和凋亡的影響。
　　 目的：
　　 通過調(diào)節(jié)miR-29a在BMSCs中的表達狀態(tài),觀察miR-29a過表達和抑制時對BMSCs增殖和凋亡的影響,并分析其調(diào)控靶基因及作用機制。
　　 方法：
　　 1.慢病毒的包裝和滴度測定。2

5、93T細胞復(fù)蘇和擴增,分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-29a前體表達病毒載體(eGFP)、miR-29a前體表達病毒對照載體(空白對照,eGFP)、miR-29a抑制劑病毒載體(mCherry)、miR-29a抑制劑病毒對照載體與包裝載體(空白對照,mCherry),48 h收獲病毒上清,分別為Lvx-miR-29a、Lvx-miR-29a-control、Lvx-miR-29a(-)、Lvx-miR-29a(-)-control,分別用病毒上

6、清液感染293T細胞,流式細胞儀分別檢測綠色或紅色熒光細胞陽性率并計算病毒滴度。
　　 2.慢病毒感染BMSCs。體外分離培養(yǎng)大鼠BMSCs,傳代至第四代BMSCs用于病毒感染,分為Lvx-miR-29a組、Lvx-miR-29a對照組、Lvx-miR-29a(-)組和Lvx-miR-29a(-)-control對照組,分別加入Lvx-miR-29a、Lvx-miR-29a-control、Lvx-miR-29a(-)、Lvx-

7、miR-29a(-)-control(MOI=10)來感染BMSCs,感染6 d后熒光倒置顯微鏡下觀察綠色或紅色熒光表達,熒光定量PCR檢測各組miR-29a表達。
　　 3.增殖和凋亡檢測。慢病毒感染6 d后消化各組細胞進行流式細胞儀檢測細胞周期與凋亡。
　　 4.生物信息學(xué)分析。采用靶基因預(yù)測結(jié)合miRNA調(diào)控的基因表達譜分析:TargetScan6.0在線預(yù)測mo-miR-29a基因的可能靶基因,結(jié)合GEO數(shù)據(jù)庫中

8、miR-29調(diào)控的基因譜數(shù)據(jù),篩選出miR-29可能下調(diào)的基因集合,進一步進行GO分析,篩選出于增殖或凋亡相關(guān)的基因。
　　 5.統(tǒng)計學(xué)分析。采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行分析。獨立實驗重復(fù)3次,數(shù)值用樣本均數(shù)±標準差(-X±S)表示,采用獨立樣本t檢驗比較兩組間差異,以α=0.05為檢驗標準。
　　 結(jié)果：
　　 1.慢病毒的包裝和滴度測定。293T細胞貼壁圓形、類圓形或多角形,排列整齊。包裝病毒后第五天即傳

9、代后24 h在熒光倒置顯微鏡下看到帶紅色或綠色熒光蛋白的細胞,流式細胞儀也檢測到帶紅色或綠色熒光蛋白的細胞,Lvx-miR-29a、Lvx-miR-29a-control、Lvx-miR-29a(-)、Lvx-miR-29a(-)-control四組的熒光細胞陽性率分別為47.8％、63%、59%及63%,分別計算Lvx-miR-29a、Lvx-miR-29a-control、Lvx-miR-29a(-)、Lvx-miR-29a(-)-

10、control的病毒滴度,分別為7.17×107 IU/ml、9.45×107IU/ml、8.85×107 IU/ml、9.45×107IU/ml。
　　 2.慢病毒感染BMSCs。體外分離培養(yǎng)大鼠的BMSCs至第四代,可以得到純化的細胞,該細胞貼壁生長,呈梭形,旋渦狀排列。病毒上清感染骨髓間充質(zhì)干細胞48 h后熒光倒置顯微鏡下可看到帶紅色或綠色熒光蛋白的梭形,貼壁生長的細胞。感染4～5天后,細胞的熒光達到最強,5天后熒光無明顯

11、改變,轉(zhuǎn)染效率約為60%。病毒感染后第6天用熒光定量PCR檢測miR-29a的表達,結(jié)果顯示:與對照組相比,Lvx-miR-29a組中miR-29a增高(5.62±1.86)倍,Lvx-miR-29a(-)組降低為(0.269±0.075)倍,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.增殖和凋亡的檢測。與對照組相比,Lvx-miR-29a組的S期細胞明顯減少,對照組和Lvx-miR-29a組處于S期的細胞分別占(17.41±

12、3.78)%和(8.52±3.06)%(P＜0.05),增殖指數(shù)分別為(30.99±4.82)%和(19.75±5.22)%(P＜0.05)。流式細胞儀檢測細胞凋亡:Lvx-miR-29a組和對照組(感染空載體)細胞的壞死率分別為(29.24±7.28)%和(14.34±4.33)%,凋亡率分別為(16.74±4.26%和(10.24±3.83)%;Lvx-miR-29a(-)和對照組(感染空載體)的細胞壞死率分別為(5.68±4.82

13、)%和(15.56±3.78)%,凋亡率分別為(4.14±2.45)%和(6.91±2.52)%。顯示miR-29a高表達促進BMSCs凋亡(P＜0.05)。
　　 4.生物信息學(xué)分析。采用靶基因預(yù)測結(jié)合miRNA調(diào)控的基因表達譜分析,首先TargetScan6.0在線預(yù)測mo-miR-29a基因的可能靶基因(797個,保守區(qū)結(jié)合),miR-29a上調(diào)引起468個基因下調(diào)(GEO database no.GSE30525),同時

14、滿足上述兩個條件的有58個基因(既是miR-29a靶基因同時受到miR-29a調(diào)控)。對這58個基因進行GO分析,發(fā)現(xiàn)4個基因與細胞周期相關(guān)(PTP4A1,HMGN3,MAFB,MYCN),6個基因具有轉(zhuǎn)錄因子功能(CSDA,EOMES,GAS7,MAFB,NFIA,MYCN),2個基因與凋亡相關(guān)(BAK1,MYCN)。在這些基因中,已有報道MYCN、HMGN3、NFIA和PTP4A1可促進細胞增殖,MYCN基因抑制BMSCs凋亡,BA