明膠海綿為支架山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合富血小板血漿移植修復(fù)纖維環(huán)缺損的實驗研究.pdf

1、目的：
　　探討研究山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSCs）的分離培養(yǎng)以及鑒定的方法，同時對山羊BMSCs的生長特性進(jìn)行研究，為下一步進(jìn)行體內(nèi)實驗奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　對BMSCs進(jìn)行梯度離心，分離出純化的BMSCs，然后利用貼壁培養(yǎng)的方法，進(jìn)行培養(yǎng)并且傳代，使得細(xì)胞進(jìn)行增殖，運(yùn)用倒置顯微鏡對第3、4代BMSCs進(jìn)行觀察。觀察細(xì)胞的形態(tài)

2、和生長情況。最后，使用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法對第3、4代BMSCs的表面標(biāo)志抗原CD29、CD34和CD44的表達(dá)，進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果：
　　山羊BMSCs在體外培養(yǎng)，成功傳代并實現(xiàn)了細(xì)胞增殖，而且通過鏡下觀察到第3、4代細(xì)胞增殖迅速，生長旺盛。細(xì)胞免疫中顯示出實驗中BMSCs對 CD29，CD44表達(dá)為陽性，對CD34表達(dá)為陰性，鑒定確為BMSCs的表達(dá)。結(jié)論應(yīng)用梯度離心法提取培養(yǎng)的 BMSCs呈現(xiàn)梭形，纖維狀生長，克隆能力

3、強(qiáng)，并且在第3、4代時候活性最強(qiáng)，增殖最快，為下一步體內(nèi)實驗的成功移植提供了良好的種子基礎(chǔ)。
　　目的：
　　研究觀察山羊富血小板血漿對山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響。
　　方法：
　　抽取6只6月齡的健康山羊頸靜脈血，采用二度離心法獲取山羊的富血小板血漿，然后運(yùn)用骨穿包從山羊髂骨上抽取山羊的骨髓，采用梯度離心的方法分離，純化獲得山羊BMSCs，然后取生長狀態(tài)較好的原代細(xì)胞，在配好的完全培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)為0.3,

4、0.2,0.1富血小板血漿，與沒有加入山羊的富血小板血漿的形成對照組。
　　結(jié)果：
　?、賹嶒灲M中加入0.1體積分?jǐn)?shù)山羊富血小板血漿的第4 d，山羊BMSCs增殖的活力增高，呈較快生長，生長曲線上升幅度增大，細(xì)胞倍增時間約50h。相比較之下，加入0.2體積分?jǐn)?shù)山羊富血小板血漿的第4 d，山羊BMSCs增殖的活力較0.1組增高，而且生長曲線幅度相對較高，細(xì)胞倍增時間縮短為35h。而加入0.3體積分?jǐn)?shù)的山羊富血小板血漿的第4d，

5、山羊 BMSCs的生長活力是最高的，生長曲線上升幅度最大，倍增時間是最短的為25h；
　?、谠谏窖駼MSCs培養(yǎng)的第4天，分別加入體積分?jǐn)?shù)為0.3，0.2，和0.1自體富血小板血漿的實驗組，與對照組比較差異有顯著性意義（P<0.05，P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　山羊富血小板血漿對于山羊BMSCs的增殖作用確實有明顯的幫助，而且體積分?jǐn)?shù)越大的富血小板血漿對于山羊BMSCs的增殖能力越顯著。越能顯著地促使完全培養(yǎng)基內(nèi)

6、山羊的BMSCs增殖。
　　目的：
　　研究以明膠海綿為載體山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合富血小板血漿移植修復(fù)纖維環(huán)缺損的組織學(xué)特性。
　　方法：
　　從山羊的髂骨中提取和分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并將其進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)到第3代時進(jìn)行細(xì)胞鑒定。然后從山羊頸靜脈進(jìn)行抽血，利用二度離心的方法制成富血小板血漿。在動物實驗中，將山羊的椎間盤按要求分為三組：空白對照組、對照組、和實驗組?？瞻讓φ战M是對椎間盤不進(jìn)行任何干預(yù)。對照組

7、是利用手術(shù)器械對纖維環(huán)造成1×1cm的缺損，然后逐層縫合切口。實驗組則是先將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞加入PBS，制成細(xì)胞懸液。在無菌的環(huán)境下將明膠海綿處理成1×1cm的小正方體，將制備好的細(xì)胞懸液打入明膠海綿中。然后對山羊進(jìn)行人工破損纖維環(huán)手術(shù)：首先在手術(shù)中清理軟組織，找到兩橫突之間白色的類似軟骨的組織，此為纖維環(huán)。用尖刀破損一個1×1cm的缺口，將復(fù)含山羊BMSCs的明膠海綿放入破損中，在海綿上層覆蓋一層膠凍狀的富血小板血漿，然后逐層進(jìn)行縫合

8、。在手術(shù)后的的3周、6周、12周三個時間段按照三個不同的分組分別取出破損后生長的組織，然后進(jìn)行HE染色、Masson三色明膠染色、AB-PAS染色、和Ⅱ型膠原的檢測。最后，對各種方法的不同組進(jìn)行對比分析。
　　結(jié)果：
　　成功的分離培養(yǎng)出第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞生長穩(wěn)定，增殖迅速，形態(tài)成梭形。以明膠海綿為載體山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合富血小板血漿成功修復(fù)了纖維環(huán)的缺損，防止了髓核的突出。在HE染色中，根據(jù)時間的分組，顯示出

9、組織中各種修復(fù)細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，細(xì)胞越成熟，修復(fù)能力越強(qiáng)。在Masson三色明膠染色中，觀察到很多成纖維細(xì)胞或者組織正在進(jìn)行修復(fù)，隨著時間的推移，纖維組織越來越多，成纖維細(xì)胞越來越增多。而在AB-PAS染色中可以看到纖維環(huán)修復(fù)的過程中，有軟骨細(xì)胞修復(fù)的參與。而且通過對Ⅱ型膠原免疫組化的檢測，顯示出Ⅱ膠原的含量是逐漸增高的。
　　結(jié)論：
　　通過分組對比，證實了山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對纖維環(huán)缺損有更好的修復(fù)能力，隨著時間的延長，