表達肝細胞生長因子的骨髓間充質(zhì)干細胞保護大鼠小肝移植物的實驗研究.pdf

1、全文分為二部分： 第一部分 含人肝細胞生長因子基因的腺病毒載體的構(gòu)建及病毒體外感染骨髓間充質(zhì)干細胞 目的：構(gòu)建含人全長肝細胞生長因子(human hepatocyte growth factor,hHGF)基因與綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)基因融合的腺病毒表達載體pDC316-HGF-IRES-EGFP，經(jīng)293細胞包裝，同源重組產(chǎn)生重組腺病毒Ad-HGF。病毒液感染骨髓間

2、充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)，研究病毒感染效率，以及hHGF基因在BM-MSCs中表達情況。 方法：將人全長HGF cDNA亞克隆入腺病毒質(zhì)粒載體pDC316-IRES-EGFP-Lacza，建立含hHGF基因的腺病毒表達載體pDC316-HGF-IRES-EGFP，采用酶切法、PCR法和測序法分別鑒定。采用同源重組法獲得含hHGF的重組腺病毒Ad5-HGF-

3、IRES-EGFP(簡寫為Ad-HGF)。用Csel密度梯度超離心法純化病毒，用空斑形成試驗進行病毒滴度測定。體外分離、培養(yǎng)BM-MSCs。以僅表達GFP基因的重組腺病毒Ad5-IRES-EGFP(簡寫為Ad-GFP)為對照，體外分別感染MSCs。熒光顯微鏡下觀察MSCs有無GFP基因表達；用熒光激活細胞分選術(Fluorescence-activated cell sorter，F(xiàn)ACS)檢測受染細胞的GFP標記以判定HGF表達。酶聯(lián)

4、免疫吸附測定法(Enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)檢測轉(zhuǎn)導細胞培養(yǎng)上清hHGF表達的濃度和持續(xù)時間。感染Ad-HGF，Ad-GFP的MSCs細胞分別命名為HGF/MSCs，GFP/MSCs。 結(jié)果：腺病毒表達載體pDC316-HGF-IRES-EGFP經(jīng)限制性內(nèi)切酶切電泳后顯示有2.3kb的hHGF目的基因片段和5.2kb的線性化pDC316-IRES-EGFP載體片段，顯示構(gòu)建的腺病

5、毒表達載體中含有hHGF基因；目的片段測序結(jié)果與Gene bank中hHGF cDNA序列一致。經(jīng)293包裝所產(chǎn)生病毒Ad-HGF，純化后滴度可以達到5.0×10<'11>pfu/mL。熒光顯微鏡下觀察到HGF/MSCs，GFP/MSCs細胞都有GFP基因表達。HGF/MSCs細胞培養(yǎng)上清中hHGF水平升高，能持續(xù)表達hHGF大約14天；最高濃度達到103 ng/mL。 結(jié)論：本實驗中腺病毒表達載體構(gòu)建正確；重組腺病毒液Ad-H

6、GF滴度高；轉(zhuǎn)導MSCs后在MSCs中獲得高效、穩(wěn)定和持續(xù)表達的hHGF。該載體達到實驗設計要求，為其在進一步的體內(nèi)、外研究奠定了物質(zhì)基礎。 第二部分 HGF/MSCs促進小移植肝再生的實驗研究 目的:建立大鼠原位30％小體積肝移植模型，并在此基礎上進一步了解大鼠行同種原位減體積肝移植后，經(jīng)門靜脈輸注表達hHGF的骨髓間充質(zhì)干細胞(HGF/MSCs)，研究其對移植后小移植肝的保護作用。 方法：(1)采用Lewis

7、大鼠，改良“二袖套法”建立大鼠30％肝移植模型，分別稱取受體肝臟重量及供肝重量。術后1，3，5，7天處死大鼠，稱取肝臟重量并取肝組織行組織學檢查，了解移植后肝臟再生的初步情況。(2)在模型建立的基礎上，將受體分為4組，每組5只，實驗組在供肝植入、門靜脈開放后，立即經(jīng)門靜脈輸注5×10<'6> HGF/MSCs。對照組則分別輸注相同體積的生理鹽水，5×10<'6> GFP/MSCs，或1.0×10<'9>pfu Ad-HGF(以上都定容至

8、1mL)。分別于術后1，3，5，7天在實驗組和對照組中各隨機抽取5只大鼠處死。取血檢測血清ALT。記錄移植物濕重。取肝組織用免疫組化法檢測肝細胞凋亡和增殖活性，或行相關的分子生物學實驗。 結(jié)果：(1)對照組大鼠30％肝移植模型7天存活率33.3％。而實驗組大鼠生存率為73.3％；(2)對照組移植物組織學檢查示術后1天中央靜脈以及肝竇擴張、部分肝細胞增大氣球樣變，3天和5天組可見匯管區(qū)單核細胞浸潤多；而實驗組肝臟結(jié)構(gòu)損傷輕，炎性細

9、胞浸潤少，二倍體和多倍體肝細胞多見；(3)HGF/MSCs輸注的大鼠在術后3天和5天時血ALT水平較對照組明顯降低；(4)實驗組移植物濕重在術后3天和5天時較對照組明顯增加；(5)術后3天和5天實驗組大鼠的肝移植物增殖和凋亡細胞明顯較對照組高；(6)實驗組大鼠28天生存率較對照組高，且移植肝肝纖維化發(fā)生率低。 結(jié)論：(1)大鼠原位部分肝移植是研究肝再生的良好實驗模型，移植肝仍具有良好的增殖活性；(2)大鼠部分肝移植后，輸注HGF