肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因修飾的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)血管新生.pdf

1、第一部分 hMSC的培養(yǎng)及HGF基因修飾后的鑒定
　　 目的:原代分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow mesenchymal stem cell，hMSC），轉(zhuǎn)染攜帶人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的腺病毒（adenovirus-hepatocyte growth factor，Ad-HGF）之后進(jìn)行鑒定。
　　 方法:利用Percoll液分離出骨髓單個(gè)核細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)72h后棄上清，繼續(xù)培養(yǎng)直至細(xì)胞生長(zhǎng)

2、匯合率達(dá)到80％，傳代或凍存。取第3代hMSC在無(wú)血清條件下轉(zhuǎn)染Ad-HGF，2h后補(bǔ)加血清，繼續(xù)培養(yǎng)48h。光鏡下觀察比較轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞形態(tài)，并通過(guò)流式鑒定hMSC/Ad-HGF的表面標(biāo)志物，酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme-linked immunoadsorption assay，ELISA）測(cè)定HGF表達(dá)量。
　　 結(jié)果:成功分離培養(yǎng)原代hMSC；HGF基因修飾前后，均為成纖維樣細(xì)胞形態(tài)；流式測(cè)定hMSC/Ad-HGF陽(yáng)性

3、表達(dá)CD44，CD29，而CD31，CD34，CD45和CD14均表達(dá)陰性，與hMSC細(xì)胞表型一致；ELISA測(cè)得hMSC/Ad-HGF的HGF表達(dá)量顯著高于hMSC（P<0.001）。
　　 結(jié)論:經(jīng)HGF基因修飾的hMSC，維持了原有的細(xì)胞形態(tài)及特異性細(xì)胞表型，且高表達(dá)HGF。
　　 第二部分 HMSC/Ad-HGF促進(jìn)雞胚血管新生
　　 目的:評(píng)價(jià)hMSC/Ad-HGF的促血管新生效應(yīng)，并初步分析其機(jī)理。<

4、br>　　 方法:利用Ad-HGF轉(zhuǎn)染hMSC，將細(xì)胞接種于雞胚絨毛膜尿囊膜，與α-MEM、同代hMSC及bFGF比較，3天后計(jì)血管數(shù)量。RT-PCR檢測(cè)hMSC表達(dá)bFGF、VEGF、血管生成素-1和血管生成素-2的水平。
　　 結(jié)果:四組中hMSC/Ad-HGF促血管生成能力最強(qiáng)，hMSC和bFGF組相近，α-MEM組最低。RT-PCR結(jié)果顯示，hMSC和hMSC/Ad-HGF均表達(dá)多種促血管生成相關(guān)細(xì)胞因子，而HGF轉(zhuǎn)染

5、后表達(dá)水平升高。
　　 結(jié)論:經(jīng)HGF基因修飾的hMSC具有較強(qiáng)的促血管新生的功能，本研究為缺血性疾病的治療提供了有益的信息。
　　 第三部分 hMSC/Ad-HGF促進(jìn)大鼠肢體局部缺血的血管新生
　　 目的:評(píng)價(jià)hMSC/Ad-HGF體內(nèi)促血管新生效應(yīng)，并探討其作用機(jī)制。
　　 方法：建立大鼠局部肢體缺血模型，利用攜帶HGF基因的重組腺病毒感染hMSC，將細(xì)胞通過(guò)肌肉注射接種于缺血區(qū)，21天后進(jìn)行激光多

6、普勒灌注成像測(cè)定，H&E染色和免疫組化評(píng)價(jià)骨骼肌微血管密度。利用MTT、Transwell及內(nèi)皮細(xì)胞體外管狀結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)hMSC/Ad-HGF對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外增殖、遷移及成管狀能力的影響。
　　 結(jié)果:21天后hMSC/Ad-HGF和hMSC組血流灌注水平明顯高于對(duì)照組（P<0.01），前者接近假手術(shù)組，顯著高于hMSC組（P<0.05）。組織學(xué)分析表明，每高倍視野肌肉組織中微血管數(shù)量以hMSC/Ad-HGF組最高，假