表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響.pdf

1、目的：本研究應(yīng)用人工體外汗腺細(xì)胞損傷的微環(huán)境，誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)向汗腺細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并通過(guò)檢測(cè)不同組別抗原的表達(dá)情況，探討表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)對(duì)轉(zhuǎn)化的影響，以及在轉(zhuǎn)化過(guò)程中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號(hào)通路的作用，為臨床應(yīng)用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞重建汗腺提供理論依據(jù)。
　　 方法：無(wú)菌條件下獲得足月妊娠分娩胎兒的臍帶，將其用剪刀剪切成4cm左右長(zhǎng)短的臍帶組織段，無(wú)菌生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，除去臍帶中殘留的

2、血液，剔除血管（一條臍靜脈，兩條臍動(dòng)脈）以避免被血管內(nèi)皮細(xì)胞污染。取出臍帶中的華通膠組織(Wharton's Jelly)，撕裂成條索狀，用剪刀將其剪成大小約1mm3的Wharton's Jelly組織塊，將組織塊置于培養(yǎng)瓶中，采用組織塊培養(yǎng)法得到臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面抗原表達(dá)情況；取人頭、面、頸部正常全層皮膚，用Ⅱ型膠原酶消化法獲得汗腺組織，培養(yǎng)汗腺細(xì)胞(h-SGCs)貼壁生長(zhǎng)，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)其為

3、純化的h-SGCs;依據(jù)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的微環(huán)境理論，將h-SGCs行熱損傷處理，消化后種植于transwell小室，將第四代的UC-MSCs種植于transwell板下層，誘導(dǎo)間充值干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，并依據(jù)處理因素不同，分為四組，組1：對(duì)照組，UC-MSCs用h-SGCs培養(yǎng)基培養(yǎng)，不加熱休克h-SGCs;組2：UC-MSCs用h-SGCs培養(yǎng)基培養(yǎng)，于transwell小室中放入熱損傷h-SGCs進(jìn)行誘導(dǎo)；組3：在組2基礎(chǔ)上，

4、加入50ng/ml的EGF;組4：在組2基礎(chǔ)上加入10ng/ml的PD98059。一周后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)共培養(yǎng)的UC-MSCs的CK7、CK19表達(dá)率，用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)其CK19、CEA的染色情況，并應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果：
　　 (1)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)顯示：①培養(yǎng)傳代的UC-MSCsCD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、CK7、CK19陽(yáng)性率分別為0.6％

5、，91.3％，0.6％，99.1％，0.9％，99.2％，0.8％，0.9％。其中CD29、CD44、CD105為干細(xì)胞表面標(biāo)志物，表達(dá)率高，CD14、CD34、CD45為造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物，幾乎不表達(dá)，證明培養(yǎng)獲得的細(xì)胞為純化的間充質(zhì)干細(xì)胞。CK7、CK19在培養(yǎng)的細(xì)胞中的陽(yáng)性率很低，說(shuō)明UC-MSCs正常情況下不表達(dá)CK7、CK19等標(biāo)志物。②對(duì)各組進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，組1CK7、CK19陽(yáng)性率分別為：(2.20±1.51)％，(

6、2.23±0.68)％；組2CK7、CK19陽(yáng)性率分別為(6.37±0.74)％，(5.73±0.32)％：組3CK7、CK19陽(yáng)性率分別為(14.3±0.96)％，(12.57±1.06)％：組4CK7、CK19陽(yáng)性率分別為(2.30±1.08)％，(2.13±0.61)％。CK7統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，組1和組4沒(méi)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.999＞0.05)，組2與組3的表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于這兩組，組2與組1(P=0.005＜0.05)，組3與

7、組1(P=0.000＜0.05)，且組3高于組2(P=0.001＜0.05)。CK19統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，組1和組4沒(méi)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.997＞0.05)，組2與組3的表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于這兩組，組2與組1：(P=0.005＜0.05)，組3與組4：(P=0.000＜0.05)，且組3高于組2(P=0.001＜0.05)；
　　 (2)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：培養(yǎng)的人UC-MSCs的CEA和CK19免疫組織化學(xué)染色為陰性，培養(yǎng)的U

8、C-MSCs不表達(dá)CEA和CK19，由于CEA和CK19表面抗原相結(jié)合可作為汗腺細(xì)胞的標(biāo)志物，說(shuō)明其不具有汗腺細(xì)胞的表型；而獲得的汗腺細(xì)胞的CEA和CK19染色均為陽(yáng)性，證明為純化的汗腺細(xì)胞。不同條件下培養(yǎng)的各組細(xì)胞均有部分細(xì)胞表達(dá)CEA和CK19陽(yáng)性，其中組3表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最高。每組選取6個(gè)視野計(jì)算各組細(xì)胞表達(dá)CEA的陽(yáng)性率，組1的CEA平均陽(yáng)性率為(3.33±0.71)％；組2的CEA平均陽(yáng)性率分別為(7.43±1.01)％；組3后

9、的UC-MSCs的CEA平均陽(yáng)性率分別為(17.63±2.31)％；組4的CEA平均陽(yáng)性率分別為(3.17±0.35)％.統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，組1和組4沒(méi)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.997＞0.05)，組2與組3的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于這兩組，組2與組1：(P=0.005＜0.05)，組3與組1：(P=0.000＜0.05)，且組3高于組2：(P=0.001＜0.05)。
　　 (3)Western blot:組1至組4各組的OD值分別為：

10、組1：(0.64±0.026)，組2:(0.79±0.049)，組3(1.20±0.032)，組4(0.62±0.042),組1與組4之間p-ERK表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.910＞0.05)，組3表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度最高，其次是組2，與組1統(tǒng)計(jì)分析后的差異分別為：(P=0.000＜0.05)、(P=0.003＜0.05)，并且組3的表達(dá)強(qiáng)度高于組2。
　　 結(jié)論：UC-MSCs與熱損傷的h-SGCs經(jīng)transwell板間接共

11、同培養(yǎng)后，部分UC-MSCs表面抗原CK7、CK19、CEA表達(dá)陽(yáng)性，證明已具有h-SGCs的表型，提示體外h-SGCs損傷的微環(huán)境具有促進(jìn)UC-MSCs向h-SGCs分化的作用；而在培養(yǎng)基加入50ng/mlEGF的組3的細(xì)胞表面抗原陽(yáng)性率明顯高于組2和對(duì)照組，加入ERK信號(hào)通路特異性抑制劑PD98059的組4與對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并且低于組2和組3，證明EGF可以明顯促進(jìn)UC-MSCs向汗腺細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并且ERK通路在通過(guò)共