Pax6基因慢病毒載體構建及在人骨髓間充質干細胞中的表達.pdf

1、暨南大學碩士學位論文題名（中英對照）：Pax6基因慢病毒載體構建及在人骨髓間充質干細胞中的表達基因慢病毒載體構建及在人骨髓間充質干細胞中的表達ConstructionoflentivirusvectcontainingPax6itsexpressioninhumanbonemarrowmesenchymalstemcells作者姓名：劉靜雯指導教師姓名：秦波及學位、職稱：博士、主任醫(yī)師學科、專業(yè)名稱：眼科學學位類型：專業(yè)學位論文提交日期

2、：2016年4月論文答辯日期：2016年5月答辯委員會主席：段宣初論文評閱人：盲審1，盲審2學位授予單位和日期：2016年6月I中文摘要中文摘要目的目的：構建攜帶Pax6基因的重組慢病毒載體，體外轉染人骨髓間充質干細胞，將目的基因整合入干細胞內并檢測其表達情況，為進一步研究骨髓間充質干細胞定向分化，以及將來視神經病變的干細胞替代治療提供實驗依據(jù)。方法方法：從人Pax6cDNA基因克隆載體pGEMPAX6上PCR擴增Pax6基因片段，將P

3、CR產物及慢病毒載體pHIVEGFP經XbaI和BamHI雙酶切后，以T4連接酶連接，同時設立pHIVEGFP空載體組作為對照，轉化DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，提取質粒，測序鑒定。經293T細胞包裝后，收集含病毒顆粒的上清液，標定滴度。以MOI=10、20、40體外轉染人骨髓間充質干細胞，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，熒光顯微鏡下觀察EGFP表達以判斷轉染是否成功，RealtimePCR檢測轉染細胞的Pax6表達。結果結果：質粒PCR及基

4、因測序證實Pax6基因與pHIVEGFP慢病毒載體連接成功，包裝后獲得滴度約為3106pfuml的Pax6EGFP重組體。轉染人骨髓間充質干細胞后，在熒光顯微鏡下可見綠色熒光，且隨培養(yǎng)時間延長，熒光強度未見衰退。RealtimePCR提示，被轉染細胞內有Pax6基因表達。結論：結論：成功構建搭載目的基因的慢病毒重組載體Pax6EGFP，以該病毒將外源基因整合到宿主細胞基因組中，獲得過表達Pax6基因的BMSCs，并可利用慢病毒載體系統(tǒng)自