Pax6基因慢病毒載體構(gòu)建及在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文題名（中英對照）：Pax6基因慢病毒載體構(gòu)建及在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)基因慢病毒載體構(gòu)建及在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)ConstructionoflentivirusvectcontainingPax6itsexpressioninhumanbonemarrowmesenchymalstemcells作者姓名：劉靜雯指導(dǎo)教師姓名：秦波及學(xué)位、職稱：博士、主任醫(yī)師學(xué)科、專業(yè)名稱：眼科學(xué)學(xué)位類型：專業(yè)學(xué)位論文提交日期

2、：2016年4月論文答辯日期：2016年5月答辯委員會主席：段宣初論文評閱人：盲審1，盲審2學(xué)位授予單位和日期：2016年6月I中文摘要中文摘要目的目的：構(gòu)建攜帶Pax6基因的重組慢病毒載體，體外轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，將目的基因整合入干細(xì)胞內(nèi)并檢測其表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化，以及將來視神經(jīng)病變的干細(xì)胞替代治療提供實驗依據(jù)。方法方法：從人Pax6cDNA基因克隆載體pGEMPAX6上PCR擴(kuò)增Pax6基因片段，將P

3、CR產(chǎn)物及慢病毒載體pHIVEGFP經(jīng)XbaI和BamHI雙酶切后，以T4連接酶連接，同時設(shè)立pHIVEGFP空載體組作為對照，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，測序鑒定。經(jīng)293T細(xì)胞包裝后，收集含病毒顆粒的上清液，標(biāo)定滴度。以MOI=10、20、40體外轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，熒光顯微鏡下觀察EGFP表達(dá)以判斷轉(zhuǎn)染是否成功，RealtimePCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的Pax6表達(dá)。結(jié)果結(jié)果：質(zhì)粒PCR及基

4、因測序證實Pax6基因與pHIVEGFP慢病毒載體連接成功，包裝后獲得滴度約為3106pfuml的Pax6EGFP重組體。轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下可見綠色熒光，且隨培養(yǎng)時間延長，熒光強(qiáng)度未見衰退。RealtimePCR提示，被轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)有Pax6基因表達(dá)。結(jié)論：結(jié)論：成功構(gòu)建搭載目的基因的慢病毒重組載體Pax6EGFP，以該病毒將外源基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，獲得過表達(dá)Pax6基因的BMSCs，并可利用慢病毒載體系統(tǒng)自