Nur77的SUMO化修飾在乳腺癌細胞中的功能.pdf

1、細胞核受體家族成員的數(shù)目繁多，它們通過對下游因子的調(diào)控，在細胞內(nèi)形成強大有序的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。在細胞調(diào)節(jié)中，核受體家族成員大多受特異性配體激活，比較特殊的一類為孤兒核受體亞族，該亞族成員的配體未知或無需配體激活就能行使核受體功能。孤兒核受體家族NR4A(Nuclear receptor subfamily4 group A)即屬于后者，其中Nur77（即NR4A1）的作用廣泛，多篇文獻報道了Nur77在神經(jīng)發(fā)育、刺激應(yīng)答等多領(lǐng)域的核心作用。近

2、年來，Nur77在癌癥研究中的價值也開始顯現(xiàn)，在前列腺癌、肺癌、膀胱癌等的研究中，Nur77的異常表達，能夠影響癌癥發(fā)生。乳腺癌細胞中，Nur77的表達量遠高于正常的乳腺細胞，這種異常表達對乳腺癌的發(fā)生是否存在影響還尚未知曉。雌激素受體α（Estrogen receptorα，ERα）作為乳腺癌發(fā)病因子，是該病癥研究的主要核心。由此，在判斷Nur77對乳腺癌細胞影響的過程中，與ERα間的作用及聯(lián)系將成為研究的重點。作為小蛋白類泛素化修飾

3、的SUMO化修飾(Small ubiquitin-related modifer，SUMO)與泛素化修飾在對底物蛋白的識別和位點結(jié)合過程中都存在競爭性，能夠極大地影響蛋白質(zhì)的細胞內(nèi)定位、穩(wěn)定性等。上文提及的NR4A家族成員中另一成員Nurr1（即NR4A2）已經(jīng)證實可以受SUMO化修飾，在結(jié)構(gòu)和功能上具有保守性的同家族成員Nur77的相關(guān)研究尚未開展。
　　綜上，本研究重點在于Nur77作為ERα的輔激活因子促進乳腺癌細胞生長;同

4、時，Nur77能被SUMO蛋白修飾，SUMO化對Nur77在乳腺癌細胞中的功能產(chǎn)生抑制作用。主要內(nèi)容如下:
　　1.通過對Nur77的氨基酸序列進行分析，賴氨酸K102和K557是潛在的SUMO化修飾位點。在Hela細胞中，通過免疫印跡和免疫共沉淀實驗確定了Nur77是SUMO化修飾的底物。接下來的免疫熒光驗證了兩者在細胞中存在共定位。為了進一步確定Nur77的SUMO化修飾位點，采用定點突變的方式，構(gòu)建了3種不同的點突變體，單突

5、變K102R、K577R，雙突變的2KR。后期的免疫共沉淀實驗中，與野生型的Nur77相比，突變體K577與2KR都無法與SUMO發(fā)生共價性的相互作用，確定主要修飾位點是K577。
　　2.Hela細胞中，通過免疫共沉淀和免疫熒光實驗確定了ERα和Nur77間存在相互作用。接下來的熒光素酶報告基因?qū)嶒炛酗@示Nur77促進ERα的轉(zhuǎn)錄活性，并且呈劑量依賴性，推斷Nur77是ERα的輔激活因子，促進乳腺癌細胞增殖。
　　3.通過