Notch1與Wnt-β-catenin信號通路對乙肝病毒X蛋白致肝細(xì)胞癌發(fā)生的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:肝細(xì)胞癌（HCC）是一種致死率極高的腫瘤，它與慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染關(guān)系密切。由于從細(xì)胞、分子水平對肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制的研究還不太透徹，所以目前還缺乏治療肝細(xì)胞癌的有效措施。因此，深入研究HCC的發(fā)病機(jī)制并找到新的治療靶點(diǎn)對HCC的治療至關(guān)重要。乙型肝炎病毒X蛋白（Hepatitis B virus X protein,HBx）是由HBV X基因（hepatitis B virus X gene,HBX）編碼的，它對HBV相

2、關(guān)HCC的發(fā)生至關(guān)重要。Notch信號通路是高度保守的信號通路，依據(jù)腫瘤細(xì)胞類型及其它信號通路（如Wnt）的狀態(tài)，Notch信號通路可能在腫瘤的不同階段發(fā)揮相反的作用。前期的研究發(fā)現(xiàn)Notch1信號通路在HBx誘導(dǎo)的人非腫瘤肝細(xì)胞系L02的惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮了必不可少的作用。因此，本課題旨在研究Notch1與Wnt/β-catenin信號通路對HBx致HCC發(fā)生的作用，并且試圖從細(xì)胞周期及凋亡調(diào)控以及Notch1與Wnt/β-caten

3、in信號通路串話等不同角度探討在此過程中兩條信號通路的關(guān)系與作用機(jī)制，以期為肝癌的靶向治療提供新思路。
　　方法:通過構(gòu)建靶向Notch1基因的短發(fā)夾RNA(shRNA)重組質(zhì)粒抑制L02/HBx細(xì)胞Notch1信號通路，觀察其對細(xì)胞增殖及裸鼠體內(nèi)成瘤的影響。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測靶向抑制Notch1對L02/HBx細(xì)胞周期及凋亡的影響，并用定量RT-PCR及Western blot分別檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)因子的mRNA及蛋

4、白表達(dá)水平。另外，用shRNA及過表達(dá)質(zhì)粒的方法分別抑制和上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路，用定量RT-PCR及Western blot法分別檢測兩條信號通路的關(guān)鍵分子及靶基因的表達(dá)，同時觀察其對細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果:Notch1 shRNA抑制L02/HBx細(xì)胞Notch1信號通路的活性，在體外抑制了細(xì)胞增殖及克隆形成，在體內(nèi)明顯抑制細(xì)胞在BALB/c裸鼠皮下的腫瘤形成。而且，阻斷L02/HBx細(xì)胞的Notch1，能

5、通過cyclingD1/CDK4通路，下調(diào)cyclinD1,CDK4,E2F1,上調(diào)p21和Rb，將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，并且通過caspase-9-caspase-3途徑，明顯促進(jìn)L02/HBx細(xì)胞的凋亡。另外，HBx能活化L02細(xì)胞的Notch1信號通路和Wnt/β-catenin信號通路，并引起肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化；抑制Notch1信號通路降低L02/HBx細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路的活性，且抑制增殖；抑制Wnt/

6、β-catenin信號通路也能明顯抑制細(xì)胞增殖，但對Notch1信號通路沒有明顯的影響；抑制Notch1后上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路能恢復(fù)因抑制Notch1對L02/HBx細(xì)胞增殖的抑制作用；而且，在此過程中，Wnt信號通路的膜受體Fzd10的表達(dá)水平與Wnt/β-catenin信號通路的活性一致。
　　結(jié)論:這些結(jié)果提示Notch1信號通路通過cyclingD1/CDK4及caspase-9-caspase-3途徑引