Musashi-2通過Wnt-β-catenin信號通路促進乙肝病毒相關性肝癌進展的作用機制研究.pdf

1、研究目的：
　　擬對MSI2基因在肝癌中與Wnt/β-catenin信號通路的關系作進一步的深入研究，以期為闡明肝癌的發(fā)生機制提供新的理論依據并為下一步可能的基因治療提供新的分子靶點。本文擬從以下三個方面進行研究:一:MSI2在HCC中的表達及臨床病理學意義研究;二:MSI2在體外實驗中對肝癌細胞惡性生物學行為的影響及機制研究;三:MSI2在體內實驗中對肝癌進展的影響及調控機制研究。
　　研究方法：
　　一.MSI2在

2、HCC中的表達及臨床病理學意義研究
　　1.應用RealtimePCR法在分子水平檢測10例肝癌患者MSI2及β-catenin基因的表達，并進一步分析MSI2及β-catenin的表達趨勢相關性。
　　2.應用免疫組織化學方法檢測106例乙肝病毒相關性肝癌及癌旁硬化肝組織芯片中MSI2及β-catenin基因的表達，分析MSI2的表達變化與肝癌臨床病理特征的相關性;分析MSI2與β-catenin的表達趨勢相關性;建立CO

3、X風險比例回歸模型，對肝癌侵襲、轉移的多種危險因素行回歸分析，并對肝癌患者總體生存及無瘤生存應用Kplan-meier法行生存分析，探討MSI2的表達變化與肝癌患者預后的關系。
　　二.MSI2在體外實驗中對肝癌細胞惡性生物學行為的影響及機制研究
　　1.應用Realtime PCR法檢測三種肝癌細胞系SMMC-7721、HepG2、Hep3B中MSI2基因的表達，篩選高表達MSI2基因的細胞系。
　　2.構建針對MS

4、I2基因的shRNA干擾表達載體，MTT法檢測不同shRNA干擾載體作用后的肝癌細胞增殖活性及細胞活力，篩選MSI2基因沉默最優(yōu)的shRNA干擾表達載體。
　　3.將攜帶RNAi表達載體的重組質粒轉染高表達MSI2基因的肝癌細胞系;應用軟瓊脂克隆形成實驗檢測不用組別肝癌細胞的克隆形成能力;應用劃痕修復實驗在不同時間點動態(tài)檢測不同組別肝癌細胞的遷移距離;Transwell法檢測不同組別肝癌細胞的穿膜細胞數;應用流式細胞儀檢測不同組別

5、肝癌細胞在不同細胞周期的凋亡分布以及對肝癌細胞周期變化的影響。
　　4.將攜帶RNAi表達載體的重組質粒轉染高表達MSI2基因的肝癌細胞系;Westernblot法及Realtime PCR法檢測不同組別Wnt/β-catenin信號通路上重要開關分子β-catenin、LEF-1、TCF-4的活性變化。
　　三.MSI2在體內實驗中對肝癌進展的影響及調控機制研究
　　1.選擇4-6周齡的SPF級裸鼠為體內實驗動物模型

6、，應用分選的高表達MSI2基因的肝癌細胞系及轉染RNAi-MSI2的細胞系行細胞培養(yǎng)擴增后建立肝癌的皮下移植瘤模型，不同時間點動態(tài)觀察腫瘤大小、體積變化，繪制腫瘤生長曲線。
　　2.應用上述建立的肝癌移植瘤模型，4周后切取腫瘤，拍照并測量腫瘤體積、重量，HE染色后對腫瘤內肝癌細胞行病理分析;應用Western blot及Realtime PCR法檢測肝癌移植瘤內Wnt/β-catenin信號通路上重要開關分子β-catenin、T

7、CF-4、LEF-1的活性變化。
　　結果：
　　一.MSI2在HCC中的表達及臨床病理學意義研究
　　1.MSI2表達上調與肝癌的進展及術后復發(fā)密切相關
　　2.MSI2在肝癌的表達與β-catenin的表達具有相關性
　　3.MSI2表達上調可預測肝癌術后患者不良預后
　　二.MSI2在體外實驗中對肝癌細胞惡性生物學行為的影響及機制研究
　　1.MSI2在肝癌細胞系中高表達
　　2.M

8、SI2可增加肝癌細胞增殖活性
　　3.MSI2可促進肝癌細胞克隆形成
　　4.MSI2可提高肝癌細胞遷移、侵襲能力
　　5.MSI2可抑制肝癌細胞早期凋亡
　　6.MSI2可改變肝癌細胞周期分布、促進細胞增殖
　　7.MSI2可上調Wnt/β-catenin信號通路下游重要效應分子β-catenin、LEF-1及TCF-4的活性
　　三.MSI2在體內實驗中對肝癌進展的影響及調控機制研究
　　1

9、.MSI2在體內促進腫瘤生長
　　為了進一步驗證MSI2對肝癌的作用及機制，我們采用SPF級4-6周齡裸鼠構建肝癌皮下移植瘤模型，模擬人肝癌內環(huán)境，以力求最客觀的驗證上述實驗結果;從繪制的腫瘤生長曲線中發(fā)現，MSI2 si-RNA組較Control組的腫瘤生長緩慢，但在最初10天內觀察，兩組腫瘤體積無明顯差異，隨時間進展，兩組腫瘤體積出現顯著差異;切取瘤體后測量腫瘤體積及重量發(fā)現，MSI2 si-RNA組與Control組腫瘤體積

10、及重量差異顯著;這說明MSI2可在體內促進腫瘤生長。
　　2.MSI2可增加肝癌細胞異型性
　　為了觀察MSI2 si-RNA組及Control組皮下移植瘤的細胞形態(tài)變化，我們將兩組切取的腫瘤行HE染色，觀察大體病理發(fā)現，MSI2 si-RNA組肝癌細胞體積較小，細胞分化程度相對高，瘤體內可見少量間質成分分布，細胞的異型性小，并可見組織壞死;Control組肝癌細胞數量多，體積豐滿，呈巢狀分布，無明顯間質成分可見，細胞核體積

11、大、分化差，細胞異型性程度高;這從微觀上說明MSI2可增加肝癌細胞異型性、提高肝癌惡性行為傾向。
　　3.MSI2可在體內上調Wnt/β-catenin信號通路下游重要效應分子β-catenin、LEF-1及TCF-4的活性
　　為了驗證MSI2在體內對肝癌生長、進展的調控機制，進一步闡明MSI2對Wnt/β-catenin信號通路下游重要效應分子β-catenin、LEF-1及TCF-4活性變化的影響，我們應用wester

12、n blot技術在蛋白水平上檢測了MSI2 si-RNA組及Control組裸鼠皮下移植瘤中MSI2、β-catenin、LEF-1及TCF-4的活性變化，結果發(fā)現，MSI2表達沉默后，Wnt/β-catenin信號通路下游重要效應分子β-catenin、LEF-1及TCF-4的表達明顯下調;我們進一步應用realtime PCR法在轉錄水平檢測了MSI2 si-RNA組及Control組裸鼠皮下移植瘤中MSI2、β-catenin、L

13、EF-1及TCF-4的表達，結果顯示，MSI2表達沉默后，MSI2 si-RNA組β-catenin、LEF-1及TCF-4的表達較Control組明顯下調;這在體內實驗中進一步驗證了MSI2對Wnt/β-catenin信號通路下游重要效應分子β-catenin、LEF-1及TCF-4的活性影響;這說明MSI2可在體內通過Wnt/β-catenin信號通路促進肝癌進展。
　　結論：
　　1.MSI2在乙肝病毒相關性肝癌中表達