重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷血管新生的影響及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、創(chuàng)傷性顱腦損傷(Traumatic brain injury, TBI)是導(dǎo)致患者死亡和長(zhǎng)期殘疾的主要病因之一,按照病理過程包括原發(fā)性損傷(Primary brain injury)和繼發(fā)性損傷(Secondary brain injury, SBI)。原發(fā)性顱腦損傷與外界直接作用有關(guān),難以干預(yù)。SBI發(fā)生于顱腦損傷后數(shù)小時(shí)至數(shù)天,包括線粒體功能的障礙、炎性反應(yīng)和細(xì)胞壞死、凋亡等,最終導(dǎo)致腦缺血、腦梗死、腦水腫等不良預(yù)后,是顱腦損傷患者

2、死亡和致殘的主要原因。然而,研究發(fā)現(xiàn),約90％的TBI患者有缺血性改變,缺血缺氧又往往伴隨出現(xiàn),所以TBI后的局部缺血缺氧就成為SBI發(fā)生、發(fā)展的主要機(jī)制之一,血管作為供血、供氧的基本結(jié)構(gòu),血管新生的相關(guān)研究就成為科研工作者和臨床醫(yī)師的研究的熱點(diǎn)。
　　血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)作為一種高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素,可以通過與內(nèi)皮細(xì)胞上的兩種受體KDR和F

3、lt-1高親和力結(jié)合,一方面直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其遷移和形成官腔樣結(jié)構(gòu);另一方面增加微血管通透性,引起血漿蛋白(主要是纖維蛋白原)外滲,并通過誘導(dǎo)間質(zhì)產(chǎn)生而促進(jìn)體內(nèi)新生血管生成。血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1/CD31)作為血管內(nèi)皮的重要標(biāo)記物,對(duì)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記的特異性很強(qiáng),并參與血管新生過程,可以有效地反應(yīng)血管新生的

4、程度。
　　近年來的研究證實(shí),促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin,EPO)對(duì)腦創(chuàng)傷、腦卒中、缺血等疾病具有保護(hù)性治療作用,但其具體機(jī)制尚不清楚。重組人促紅細(xì)胞生成素(Recombinant human erythropoietin,rhEPO)是一種通過使用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的、含有與天然分離的EPO完全相同氨基酸序列的糖蛋白,與天然EPO具有相同的生物學(xué)特性。Nakano M等人就曾通過小鼠缺血再灌注損傷模型研究得出E

5、PO誘導(dǎo)VEGF產(chǎn)生,進(jìn)一步促進(jìn)血管生成的結(jié)論。
　　我們假設(shè)rhEPO的這種促血管形成作用在大鼠TBI模型中同樣適用,那么TBI后rhEPO的干預(yù)可能會(huì)成為一種新的改善腦外傷預(yù)后的治療方法。
　　第一部分重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠VEGF分泌及血管新生的影響
　　目的:通過觀察應(yīng)用促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)對(duì)大鼠TBI后,不同時(shí)間點(diǎn)挫傷灶及周圍腦組織VEGF和CD31的表達(dá)變化,探討rhEPO對(duì)TBI后

6、血管新生的影響。
　　方法:成年健康雄性SD大鼠90只,隨機(jī)分為對(duì)照組(Sham組,n=6只)、顱腦損傷組(TBI組,n=42只)和rhEPO干預(yù)組(TBI-rhEPO組,n=42只)。通過改良Feeney法建立顱腦損傷(TBI)模型,按傷后留取標(biāo)本時(shí)間分為TBI-6h、TBI-24h、TBI-3d、TBI-5d、TBI-7d、TBI-10d和TBI-14d共7個(gè)亞組,每亞組各6只,用正常大鼠作為Sham組,TBI-rhEPO組造

7、模后即刻腹腔注射rhEPO注射液(3000 IU/kg)及生理鹽水(0.5mg/kg)(用作實(shí)驗(yàn)第二部分對(duì)照),以后每天同一時(shí)間點(diǎn)給藥一次,Sham組及TBI組于同一時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等量生理鹽水,直至動(dòng)物被處死。于預(yù)定時(shí)間點(diǎn)行神經(jīng)功能損傷評(píng)分(NSS),每亞組隨機(jī)取三只大鼠處死后取挫傷灶及周圍腦組織通過PT-PCR檢測(cè)VEGF、CD31 mRNA表達(dá)情況;剩余的3只大鼠采用HE染色觀察傷后病灶的病理變化,采用免疫組織化學(xué)方法(SP法)檢測(cè)

8、挫傷灶及周圍腦組織中VEGF和CD31蛋白的表達(dá)情況,應(yīng)用顯微圖像分析系統(tǒng)計(jì)算陽性細(xì)胞并測(cè)定其平均光密度值。
　　結(jié)果:(1)RT-PCR sham組SD大鼠腦組織未檢測(cè)到VEGF及CD31 mRNA明顯表達(dá),TBI后挫傷灶及周圍腦組織VEGF、CD31 mRNA的表達(dá)均在TBI-6h開始升高,至TBI-3d表達(dá)量達(dá)到峰值,隨后均呈下降趨勢(shì),至TBI-14天表達(dá)稍減弱,但仍為高表達(dá)狀態(tài),而VEGF、CD31 mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)

9、(r=0.9239,P<0.001),與TBI組比較, TBI-rhEPO組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織VEGF及CD31 mRNA表達(dá)量均明顯升高(P<0.05);(2)免疫組化 sham組大鼠腦組織未檢測(cè)到VEGF及CD31蛋白的明顯表達(dá),顱腦損傷后挫傷灶及周圍腦組織VEGF、CD31蛋白的表達(dá)均在TBI-6h開始表達(dá),至TBI-5d至表達(dá)高峰,并持續(xù)高表達(dá)至TBI-10d,至TBI-14d稍下降,但仍處于高表達(dá)狀態(tài)。與TBI組比較,TBI

10、-rhEPO組不同時(shí)間點(diǎn)挫傷灶及周圍腦組織VEGF和CD31蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05),且VEGF蛋白表達(dá)與CD31蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.9813, P<0.001);(3)神經(jīng)功能評(píng)分(NSS) sham組SD大鼠NSS評(píng)分為0分,顱腦損傷后, TBI-rhEPO組和TBI組NSS評(píng)分均隨著時(shí)間的推移而逐漸下降,但TBI-rhEPO組下降更明顯,且在TBI-24h~TBI-14d,TBI-rhEPO組NSS明顯低于TBI組

11、,與TBI組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:顱腦損傷早期應(yīng)用rhEPO,可通過上調(diào)VEGF和CD31的表達(dá),進(jìn)而起到對(duì)大鼠顱腦損傷的保護(hù)作用。注重于血管新生的靶向治療,可一定程度減輕挫傷灶及周圍腦組織缺血缺氧,阻止腦水腫、腦梗死等不良預(yù)后的發(fā)生發(fā)展,達(dá)到改善腦外傷預(yù)后的目的。
　　第二部分重組人促紅細(xì)胞生成素促進(jìn)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠血管新生的相關(guān)機(jī)制研究
　　目的:通過觀察予以渥曼青霉素(wortman

12、nin)干預(yù)的TBI后大鼠損傷灶及周圍腦組織中VEGF和CD31的表達(dá)變化,探討rhEPO促進(jìn)TBI后大鼠血管新生的可能機(jī)制。
　　方法:42只健康雄性SD大鼠通過改良Feeney法建立TBI模型后,即刻腹腔注射重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)注射液(3000IU/kg)及wortmannin(0.5mg/kg),以后每天同一時(shí)間點(diǎn)給藥一次,直至動(dòng)物被處死,記為TBI-WM組,根據(jù)傷后處死時(shí)間隨機(jī)分為TBI-6h、TBI-24h

13、、TBI-3d、TBI-5d、TBI-7d、TBI-10d和TBI-14d共7個(gè)亞組,每亞組各6只。于預(yù)定時(shí)間點(diǎn)行神經(jīng)功能損傷評(píng)分(NSS),每亞組隨機(jī)取三只大鼠處死后取挫傷灶及周圍腦組織通過PT-PCR檢測(cè)VEGF、CD31 mRNA表達(dá)情況;剩余的3只大鼠采用HE染色觀察傷后病灶的病理變化,采用免疫組織化學(xué)方法(SP法)檢測(cè)挫傷灶及周圍腦組織中VEGF和CD31蛋白的表達(dá)情況,應(yīng)用顯微圖像分析系統(tǒng)計(jì)算陽性細(xì)胞并測(cè)定其平均光密度值。第

14、一部分實(shí)驗(yàn)中TBI組及TBI-rhEPO組作為本部分實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。
　　結(jié)果:(1)RT-PCR TBI-rhEPO組SD大鼠挫傷灶及周圍腦組織VEGF、CD31 mRNA的表達(dá),在TBI-6h開始升高,至TBI-3d表達(dá)量達(dá)到峰值,隨后呈下降趨勢(shì),至TBI-14d表達(dá)稍減弱,但仍為高表達(dá)狀態(tài);與TBI-rhEPO組比較,TBI-WM組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織VEGF及CD31 mRNA表達(dá)量均明顯下降(P<0.05);(2)免疫組化

15、TBI-rhEPO組SD大鼠腦組織VEGF和CD31的表達(dá),在TBI-6 h開始表達(dá), TBI-5d表達(dá)量達(dá)到高峰,高表達(dá)持續(xù)至TBI-10d,至TBI-14d稍下降,但表達(dá)量仍較高,TBI-WM組不同時(shí)間點(diǎn)挫傷灶及周圍腦組織VEGF和CD31蛋白表達(dá)均明顯下降(P<0.05);(3)神經(jīng)功能評(píng)分(NSS) TBI-rhEPO組和TBI-WM組NSS均隨著時(shí)間的推移而逐漸下降,但TBI-rhEPO組下降更明顯,且在傷后24h~14d,T